Резюме

Резистентността към лептин е основна причина за затлъстяването при хората. Основен компонент на тази резистентност е вероятно нарушен транспорт на лептин през кръвно-мозъчната бариера (BBB). Най-тлъстата подгрупа на иначе нормални 12-месечни CD-1 мишки имат тежко нарушен транспорт на лептин през BBB. Не е известно обаче дали тези мишки се раждат с увреждане на BBB или го придобиват със стареене и затлъстяване. Тук установихме в рамките на иначе нормална популация от CD-1 мишки, че 10% най-дебелите мишки наддават на тегло в продължение на 12 месеца живот, докато 10% най-тънките мишки натрупват малко тегло след 3 месечна възраст. Най-дебелите мишки са получили прогресивно увреждане на способността си да транспортират лептин през BBB, докато най-тънките мишки са имали скорост на транспорт, която не се е променяла с възрастта. Мастните мишки на гладно в продължение на 24 часа или третирането им с лептин води до умерено намаляване на теглото и развитие на скоростта на транспортиране на лептин през BBB, подобно на тези при тънки мишки. Тези резултати показват, че при мишки със затлъстяване CD-1 нарушеният транспорт на лептин през BBB се развива в тандем със затлъстяването и е обратим с дори умерено намаляване на теглото.

транспорт

човешкото затлъстяване представлява състояние на резистентност към лептин. Резистентността е вероятно причинена от комбинация от резистентност на нивата на рецептора и пострецептора, както и намалената способност на кръвно-мозъчната бариера (BBB) ​​да транспортира циркулиращия лептин в мозъка. Няколко проучвания са документирали различни видове доказателства за нарушен транспорт на лептин през BBB. Например, затлъстелите хора имат намалено съотношение цереброспинална течност към серум за лептин (8, 22), а някои плъхове със затлъстяване, които вече не реагират на периферно администриран лептин, все още могат да реагират на лептин, приложен директно в централната нервна система 23). Пряко увреждане на транспорта на лептин през BBB е показано при затлъстели плъхове и мишки (5, 7, 9, 17).

Остава въпросът дали дефектите в транспорта на лептин са присъщи на животните, предназначени да станат затлъстели, или са придобити със затлъстяването. Този въпрос е ключов за разбирането на ролята на BBB в лептиновата резистентност и лечението на затлъстяването. Ако транспортиращият лептин е дефектен преди появата на затлъстяване, това би предполагало, че дефектът играе основна роля в развитието на затлъстяването. Освен това би предположило, че склонността към затлъстяване и степента, до която индивидът ще затлъстее, могат да бъдат определени чрез изследване на свойствата на BBB. Ако дефектът на ВВВ бъде придобит, това предполага, че някакъв фактор, може би обратим, който възниква с развитието на затлъстяване, индуцира дефекта на ВВВ. Може да възникне положителен цикъл на нарастване на затлъстяването, нарушение на транспорта на BBB и резистентност към лептин. Такова придобито обезценка обаче може да бъде обърнато, ако може да се идентифицира отговорният фактор.

Тук използвахме модела на затлъстяване на зрялост, за да изследваме дали дефектите в транспорта на лептин са придобити или присъщи. Този модел зависи от естествената склонност на подгрупа от иначе нормални CD-1 мишки да наддават на тегло с напредването на възрастта (21). Сред 12-месечните мъже най-тежките 10% тежат ∼60% повече от най-леките 10% (3). Затлъстяването, а не мускулите или костите, представлява по-голямата част от тази разлика в теглото (2, 21). Тези проучвания също така установяват, че до 12 месечна възраст 10% най-тежките мишки транспортират интравенозно администриран лептин през BBB със скорост само около една трета от тази на 10% най-леките мишки. За разлика от това, стареенето и увеличеният соматичен растеж, съпътстващ стареенето при мишки, не са имали ефект върху транспорта на лептин. Това беше показано от сходната скорост на транспортиране на лептин при 12-месечни мишки и 2-месечни мишки, избрани да представят средните тегла за техните възрастови групи.

Тук първо потвърдихме и разширихме предишната констатация, като измерихме скоростта на транспортиране на лептин през BBB за диапазон от възраст между 6 седмици и 12 месеца. След това изследвахме транспортните норми за пълен набор от телесни тегла, а не само за горните и долните 10%, в рамките на възрастова група. И накрая, сравнихме ефекта върху транспорта на лептин при загуба на телесно тегло, причинена или на гладно, или чрез прилагане на лептин.

Мишки и жилища. CD-1 мъжки мишки (Charles River Labs, Уилмингтън, Масачузетс) бяха настанени в 12: 12 часа светло-тъмни условия Мишките бяха придобити или на възраст 4 седмици, или като 4-месечни пенсионирани животновъди. Мишките са били между 2 седмици и 10 месеца в съоръжението Amgen. Мишките получават храна и вода по желание. Където е посочено, други мишки са получени от размножителните колонии на CD-1 мишки в Медицинския център за ветераните (VA) в Сейнт Луис, Мисури. Всички проучвания са извършени по одобрени протоколи.

Радиоактивно етикетиране. Лептинът (Amgen, Thousand Oaks, CA) е радиоактивно белязан по метода на ензимните гранули (Pierce, Rockford, IL) със 125 I, закупен от Amersham Pharmacia (Piscataway, NJ). Радиоактивно белязаният лептин (I-Lep) се отделя от свободния йод върху колона Sephadex G-10. I-Lep има специфична активност от ∼100–125 Ci/g и се съхранява при 4 ° C до употреба. Албуминът е белязан с 131I по метода на хлорамин-Т и е пречистен на колона от Sephadex G-10.

Измерване на скоростта на транспортиране на лептин в мозъка. Скоростта на еднопосочен приток (Ki) от кръвта към мозъка е измерена чрез многократен регресионен анализ (6, 20). Мишките бяха упоени с уретан, а лявата югуларна вена и дясната каротидна артерия бяха изложени. На мишките беше приложена инжекция в югуларната вена от 0,2 ml разтвор на Ringer (LR) с лактат, съдържащ 1% говежди серумен албумин (BSA) и ~ 10 6 cpm I-Lep. Кръв от каротидната артерия се получава между 1 и 10 минути след интравенозно инжектиране и се центрофугира за 10 минути при 5000 ж при 4 ° С и се определя нивото на радиоактивност в серума. Веднага след събирането на артериалната кръв, мишката беше обезглавена и беше определено нивото на радиоактивност в целия мозък (с отстранени хипофизната и епифизната жлеза). Съотношенията на мозъка към серума (мозък/серум) на I-Lep в единици микролитра на грам са нанесени спрямо времето на експозиция (освен в минути)

Транспорт на лептин с настъпване на затлъстяване на зрялост. Групи от 100 мишки бяха настанени до 6 седмици или на възраст 2, 3, 6, 9 или 12 месеца. След това мишките бяха претеглени и бяха избрани 10% най-тежките (мазнини) и 10% най-леките (тънки) мишки. Ki се определя, както е описано по-горе.

Връзка между телесното тегло и транспорта на лептин на 5 месечна възраст. Пенсионирани развъдни мишки на възраст 5 месеца (н = 100) бяха претеглени и им бяха присвоени номера от 1 (най-лекия) до 100 (най-тежкия) и разделени на групи по 10. Ki беше измерен в следните групи: 1–10 (най-малък), 21–30 (следващ най-малък), 41– 50 (ниска средна), 51–60 (висока средна), 71–80 (следваща по големина) и 91–100 (най-голяма).

Ефекти от гладуването и прилагането на лептин. Пенсионираните развъдни мишки на възраст 5 месеца (от Сейнт Луис, Вирджиния) бяха претеглени и бяха избрани 10% най-тежките (мазнини) и 10% най-леките (тънки). Най-тежките мишки бяха разделени на три групи, докато беше използвана само една от всеки три от най-леките мишки. Всички мишки получиха интраперитонеална инжекция на фосфатно буфериран разтвор сутрин в продължение на четири последователни дни (дни 1–4). Лептин (10 mg/kg) е включен в инжекциите на една от групите тежки мишки (Fat-Leptin group). Друга тежка група е гладувала за 24 часа, започвайки от сутринта на ден 4 (Дебела група). Другата тежка група (Fat-Control group) и лека група (Thin-Control group) са получили интраперитонеалните инжекции на PBS, но без лептин; не бяха постили. Поглъщането на лептин е изследвано сутринта на ден 5 чрез инжектиране на I-Lep интравенозно и събиране на проби от мозъка и серума 10 минути по-късно, както е описано по-горе.

За да се определи кои фактори, различни от загубата на мазнини, биха могли да отчетат намаляване на телесното тегло, произволно избрани пенсионирани животновъди (от Сейнт Луис, Вирджиния) са били третирани както по-горе (контрол, 24-часово бързо, лечение с лептин). Сутринта на ден 5, на мишките се прилага интравенозно инжектиране на албумин, радиоактивно белязан със 131 I (2,5 × 105 cpm/мишка). Десет минути по-късно от сънната артерия се взема артериална кръв и се определя нивото в серума на радиоактивен албумин. Съдовото пространство се изчислява като cpm, инжектиран интравенозно (2.5 × 105 cpm/мишка), разделен на cpm, наличен в милилитър артериален серум. Нивата на лептин също се измерват в серум с комплекта ELISA за миши лептин (Linco, St. Charles, MO). Целият стомашно-чревен тракт се отстранява, претегля, измива се от храна и фекални материали и се претегля отново.

Статистика. Средствата са представени с техните SE и е даден броят на мишките в статистическата клетка (н). Средствата се сравняват с ANOVA, последвано от теста на Newman-Keuls, когато е подходящо. Регресионните линии са изчислени по метода на най-малките квадрати и са сравнени статистически със софтуерния пакет в Prism 3.0 (GraphPad, Сан Диего, Калифорния).

Транспорт на лептин и телесно тегло. Изследвани са мишки на възраст между 6 седмици и 12 месеца. Скоростта, с която 10% най-тънките мишки наддават на тегло, намалява значително след mo3 месечна възраст, така че 12-месечните тънки мишки тежат само ∼10% повече от 3-месечните тънки мишки (Фиг. 1A). За сравнение, мастните мишки продължават да наддават, така че 12-месечните мазни мишки тежат с 46% повече от 3-месечните мазни мишки.

Фиг. 1.Телесно тегло и скорост на транспортиране на лептин при слаби и дебели мишки. A: средно тегло на тялото за 10% най-леките (тънки) и 10% най-тежки (мазнини) мишки между 6 седмици и 12 месеца. Б.: скорост на приток от кръв към мозъка (Ki) на белязан лептин (I-Lep) за 10% най-леките (тънки) и 10% най-тежките (мазнини) мишки.

Скоростта на навлизане (Ki) на I-Lep не се променя с остаряването на тънките мишки (Фиг. 1Б.), със стойности, вариращи от 0,45 до 0,62 μl · g -1 · min -1. При затлъстели мишки Ki се променя значително в зависимост от възрастта, като намалява от максимум при 6 седмици от 0,482 μl · g -1 · min -1 до минимум при 12 mo от 0,176 μl · g -1 · min -1 (r = 0.900, н = 6, P

маса 1 Изчерпване на капилярите и киселинни валежи при тънки мишки срещу мазнини

Стойностите за паренхимните и капилярните отделения (изчерпване на капилярите, означава ± SE) са в μl/g. % P,% кортикално белязан лептин (I-Lep), открит в паренхимно отделение. Разпределението не се различава с телесното тегло. Възстановяването на радиоактивността (киселинно утаяване, означава ± SE) не се различава значително между тънки и мазни мишки и се определя главно като I-Lep. Контролните стойности за серум и мозък са съответно 89 и 83,9%.

Връзка между телесното тегло и транспорта на лептин на 5 месечна възраст. Най-тежките мишки тежат с 48% повече от най-леките мишки. Фигура 2 показва стойностите за Ki за шестте групи. Вмъкването показва корелацията между Ki и телесното тегло, което беше статистически значимо (r = 0,926, н = 6, P

Фиг. 2.Скоростта на приток на кръв към мозъка за 5-месечни мишки като функция от телесното тегло. Графика, Ki за 6 категории, вариращи от 10% най-леките (най-малките) до 10% най-тежките (най-големите). Вмъкване, Ki се начертава спрямо средните стойности на телесното тегло за тези групи.

Ефекти от гладуването и прилагането на лептин. ANOVA показа разлики между четирите групи и за двете телесни тегла [F(3,34) = 65,6, P

Фиг. 3.Ефекти от гладуването и прилагането на лептин. A: Дебелите мишки са загубили значително количество тегло, но лекуваните с лептин мишки (Fat-Leptin group) са имали нестатистически значителен спад в телесното тегло. Б.: както гладуването, така и лечението с лептин увеличават усвояването на лептин от мозъка до нива, подобни на тези, наблюдавани в групата Thin-Control Пунктирани линии, P

При други произволно избрани пенсионирани животновъди, както на гладно, така и на прием на лептин значително намалява телесното тегло. Тези лечения обаче не са имали статистически значим ефект върху съдовото пространство или стомашно-чревното тегло (Таблица 2), като по този начин се изключват възможностите загубата на тегло да е причинена от дехидратация или липса на съдържание в стомашно-чревния тракт, а не от загуба на мазнини. Няма значителна разлика между серумните нива на лептин. Това показва, че увеличаването на транспорта на I-Lep не може да се обясни с намаляване на конкуренцията от повишени ендогенни нива на серумен лептин.

Таблица 2 Ефекти от гладуването и лечението с лептин върху телесно тегло, стомашно-чревно тегло, съдово пространство и серумни нива на лептин