Роли Куриране на данни, формален анализ, разследване, методология, администриране на проекти, ресурси

gdf15

Отделения за кардиометаболитни нарушения; Amgen Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, САЩ

Роли Куриране на данни, разследване, методология

Отделения за кардиометаболитни нарушения; Amgen Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, САЩ

Роли Куриране на данни, разследване, методология

Отделения за кардиометаболитни нарушения; Amgen Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, САЩ

Роли Концептуализация, формален анализ, методология, администриране на проекти, ресурси, надзор

Отделения за кардиометаболитни нарушения; Amgen Inc., Южен Сан Франциско, Калифорния, САЩ

  • Thanhvien Tran,
  • Jingping Yang,
  • Джонита Гарднър,
  • Юмей Ксионг

Фигури

Резюме

Фармакологичното лечение на протеини на рекомбинантен растежен диференциращ фактор 15 (GDF15) намалява телесното тегло при затлъстели гризачи и примати. Парадоксално е, че нивата на циркулиращ GDF15 се увеличават при затлъстяване. За да изследваме ролята на ендогенния GDF15 в развитието на затлъстяването, ние поставихме нокаутиращи мишки GDF15 и контроли от див тип на диета с високо съдържание на мазнини, за да развият индуцирано от диетата затлъстяване. В сравнение с животни от див тип, нокаутираните мишки GDF15 са по-податливи на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини. Мъжки нокаутиращи мишки показват по-лош глюкозен толеранс, по-ниска двигателна активност и по-ниска скорост на метаболизма от мишки от див тип. Освен това дефицитът на GDF15 увеличава появата на кожни лезии, предизвикани от диета с високо съдържание на мазнини. Нашите данни показват, че ендогенният GDF15 има защитна роля в развитието на затлъстяването и липсата на GDF15 утежнява прогресията на затлъстяването и свързаните с него патологични състояния. Повишените нива на GDF15 при затлъстяване може да са резултат от реакция за преодоляване на резистентността към GDF15.

Цитат: Tran T, Yang J, Gardner J, Xiong Y (2018) Дефицитът на GDF15 насърчава затлъстяването, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини при мишки. PLoS ONE 13 (8): e0201584. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201584

Редактор: Джонатан М. Питърсън, Държавен университет в Източен Тенеси, САЩ

Получено: 6 март 2018 г .; Прието: 18 юли 2018 г .; Публикувано: 2 август 2018 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Това изследване беше финансирано от Amgen Inc, която изигра роля в дизайна на изследването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Изследването е инициирано, проектирано и проведено в подкрепа на откриването и разработването на наркотици на Amgen. Авторите са наети от Amgen и акционери на Amgen stock. Конкретни роли на тези автори са формулирани в раздела „авторски принос“.

Конкуриращи се интереси: Принадлежността на авторите към Amgen не променя придържането на авторите към всички политики PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

Затлъстяването е основна тежест за общественото здраве, свързано с животозастрашаващи съпътстващи заболявания [1, 2]. Разпространението на затлъстяването се е увеличило през последните няколко десетилетия, за да достигне статут на пандемия [3, 4]. GDF15 е трансформиращ се фактор на растежен фактор β (TGF-β), който наскоро генерира широк интерес като нова цел за разработване на фармакотерапии за затлъстяване и свързаните с това съпътстващи заболявания. Докладите от множество групи ясно показват, че лечението на рекомбинантни GDF15 протеини намалява телесното тегло и подобрява глюкозния толеранс при затлъстели гризачи и примати [5–10]. Фармакологичните проучвания са в съответствие с предишни доклади за трансгенни мишки GDF15, които са устойчиви на затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини (DIO) и непоносимост към глюкоза [11–14], подкрепяйки терапевтичната роля на високите нива на екзогенен GDF15 при лечение на затлъстяване и диабет.

Биологичната функция на ендогенния GDF15 не е напълно ясна. Съобщава се, че нокаутираните мишки GDF15 са малко по-тежки от мишки от див тип [15], претърпяват по-тежки сърдечни увреждания след исхемична/реперфузия [16] и показват известна постнатална загуба на моторни и сензорни неврони [17]. Съобщените фенотипове са леки и окончателното разбиране на биологичната роля на ендогенния GDF15 остава неуловим. Циркулиращите нива на GDF15 са ниски при нормални физиологични условия, но са повишени при бременност, стареене и някои заболявания [18–22]. По-рано съобщавахме, че нивата на циркулиращ GDF15 се повишават при затлъстели мишки, плъхове и хора [8]. Не е ясно обаче защо циркулиращите нива на GDF15 се увеличават при затлъстяване и дали ендогенният GDF15 участва в развитието на затлъстяването.

Епидемиологията и лабораторните изследвания показват, че повишеният прием на мазнини е важен фактор, допринасящ за пандемията на затлъстяването [3, 23, 24]. Диетичното хранене с високо съдържание на мазнини предизвиква затлъстяване и при модели на гризачи, осигурявайки полезен инструмент за изследване на затлъстяването [24, 25]. За да проучим дали циркулиращият ендогенен GDF15 играе функционална роля в развитието на затлъстяването, ние поставихме нокаутиращи мишки GDF15 и контроли от див тип на диета с високо съдържание на мазнини и проучихме въздействието на дефицита на GDF15 при тези мишки, предизвикани от диета (DIO).

Материали и методи

Изследване на животни

Всички изследвания на гризачи са одобрени от Amgen Institutional Animal Animal Committee and Use Committee (IACUC) и са проведени в Amgen Inc. (South San Francisco, CA). Животните се държат в помещения с 12-часов цикъл светлина/тъмнина, температура 22 ° C и влажност 30% до 70%. Животните са имали свободен достъп до храна и вода и са били поддържани на стандартна храна за гризачи (Teklad global 18% protein, Envigo 2018)), освен ако не е посочено друго.

За диетични проучвания с високо съдържание на мазнини, животните са били на 60% ккал мазнини (D12492, Research Diets).

Нокаутиращи мишки GDF15

GDF15 конститутивни нокаутиращи мишки на смесен фон 129S x C57Bl/6 са получени от Taconic Knockout Repository (Taconic, модел # TF2337). Животните бяха отгледани до фона C57BL/6NTac, за да бъдат напълно вродени (река Чарлз). Генът GDF15 има 2 екзона. Нео касета беше вмъкната в екзон 2, за да генерира нокаутиращите мишки. Генотипизирането на нокаутиращи мишки GDF15 беше проведено чрез PCR анализ на ДНК от проби от ухо, използвайки 3 PCR праймера: общ праймер 5'-TCCCACATCAGCTGTCAGTC-3 ', див тип обратен праймер 5'-CTACACCCCGGTGGTTCTTA-3', неокасетен обратен праймер 5'-CGTTGGGCT -3 '. PCR продуктът на алел от див тип е 418bp. PCR продуктът на нокаут алела е 540bp.

GDF15 ELISA

Циркулиращите нива на GDF15 са измерени с помощта на комплект за мишка/плъх GDF-15 Quantikine ELISA (системи за научноизследователска и развойна дейност)

Телесно тегло и прием на храна

Телесното тегло се измерва на всеки 2 седмици в домашните клетки. За измерване на приема на храна бяха подготвени чисти клетки с предварително претеглена храна, животните бяха прехвърлени в тези клетки в редовно време за смяна на клетките, приемът на храна се измерва два пъти седмично в продължение на 2 седмици.

Състав на тялото

Мастната маса, чистата маса и течността при съзнателни мишки се измерват с помощта на TD-NMR анализатор на миниспециален състав на тялото (Bruker)

Кръвна глюкоза и серумен инсулин

Нивата на кръвната глюкоза бяха измерени с помощта на AlphaTrak 2 глюкозна лента (Abbott Diagnostics). Нивата на серумен инсулин бяха измерени с помощта на миши инсулинов комплект ELISA (Alpco)

Тест за толерантност към глюкоза

Животните са гладували в продължение на 4 часа преди измерване на изходната глюкоза в кръвта, вземане на проби от кръв и орален глюкозен болус (20% глюкоза, 10 ml/kg). След предизвикване на глюкоза, нивата на глюкоза в кръвта се измерват на 15, 30, 60 минути.

Непряка калориметрия

Индиректната калориметрия беше проведена с помощта на 12-камерна лабораторна система за наблюдение на животни (CLAMS) Oyxmax (Columbus). Животните се аклиматизират в камерите за период до 2 седмици, за да се стабилизира телесното тегло преди събирането на данни. По време на проучването бяха взети проби на интервал от 13 минути за измерване на потреблението на O2 и производството на CO2 и изчисляване на скоростта на дихателен обмен (RER) и производството на топлина. Приемът на храна се записва на всеки 13 минути като промени в теглото на хранилката. Локомоторната активност се измерва чрез счупване на инфрачервени лъчи.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на софтуера Graph Pad Prism (Graph Pad Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) и P Фиг. 1. Мъжете GDF15 бяха по-склонни към затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини.

(А) Телесно тегло на мъжки мишки. (Б) Тегло на женските мишки. (C) Среден дневен прием на храна. (D) Състав на тялото на мъжки мишки. n = 12–21 за мъжки мишки. n = 11–22 за женски мишки. Данните са показани като средно ± SEM. * p Фигура 2. Мъжки нокаутиращи DIO мишки GDF15 са имали по-високи нива на глюкоза, нива на инсулин и влошен глюкозен толеранс.

(A) 4 часа нива на кръвната захар на гладно при мъжки мишки. (B) 4 часа нива на кръвната захар на гладно при женски мишки. (C) 4 часа нива на серумен инсулин на гладно при мъжки мишки. (D) 4 часа нива на серумен инсулин на гладно при женски мишки. (E) Нива на глюкоза в кръвта на мъжки мишки по време на орален тест за глюкозен толеранс. (F) Нива на глюкоза в кръвта на женски мишки по време на орален тест за толерантност към глюкоза. n = 12–21 за мъжки мишки. n = 11–22 за женски мишки. Данните са показани като средно ± SEM. * p Фигура 3. GDF15 нокаутиращи DIO мишки са имали по-високо телесно тегло и по-висока честота на кожни лезии.

(А) Телесно тегло на мъжки мишки GDF15 (n = 6-14). (B) Тегло на женските мишки (n = 8–13). (C) Брой на случаите на кожни лезии и възраст на първото наблюдение. Данните за телесното тегло са показани като средно ± SEM. * p Фигура 4. Мъжки нокаутиращи DIO мишки GDF15 са имали по-ниска двигателна активност.

(А) Активност по оста X на мъжки DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (B) Z-ос активност на мъжки DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (C) Непрекъснато 3-d запис на приема на храна от мъжки DIO мишки. (D) Кумулативен прием на храна от мъжки DIO мишки. n = 6. Необработените записани данни в CLAMS са показани като средни стойности. Анализираните средни стойности са показани като средна стойност ± SEM. * p Фиг. 5. Локомоторна активност и прием на храна от женски мишки.

(А) Активност по оста X на женски DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (B) Z-ос активност на женски DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (C) Непрекъснат 3-дневен запис на приема на храна от женски DIO мишки. (D) Кумулативен прием на храна от женски DIO мишки. n = 5-7. Данните от необработените CLAMS са показани като средни стойности. Анализираните средни стойности са показани като средна стойност ± SEM.

Мъжки нокаутиращи DIO мишки GDF15 са имали по-ниска скорост на метаболизма от мишки от див тип

След това анализирахме скоростта на метаболизма и RER, като използвахме консумацията на O2 и производството на CO2, измерени в камерите на Oxymax. Мъжки нокаутиращи DIO мишки GDF15 показват по-ниска консумация на O2 и производство на топлина от мишки от див тип, което показва по-ниска скорост на метаболизъм в нокаутиращите мишки (Фигура 6А и 6В). Няма разлики в RER, изчислени като съотношение на производството на CO2 към потреблението на O2, което предполага, че дефицитът на GDF15 не е повлиял на избора на енергиен субстрат (Фигура 6C). 3-d консумацията на O2 и производството на топлина при женски нокаутиращи DIO мишки GDF15 също се проследява по-ниско от тези на мишки от див тип, но средните стойности на всеки лек цикъл не се различават статистически между генотипите (Фигура 7А и 7В).

(A) Консумация на кислород при мъжки DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (B) RER на мъжки DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (C) Производство на топлина от мъжки DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. n = 6. Записаните данни от CLAMS са показани като средни стойности. Анализираните средни стойности са показани като средна стойност ± SEM. * p Фигура 7. Скорост на метаболизма и RER на женски мишки.

(A) Консумация на кислород при женски DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (B) RER на женски DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. (C) Производство на топлина от женски DIO мишки: непрекъснат 3-d запис и средна стойност на всеки светлинен цикъл. n = 5-7. Записаните данни на CLAMS са показани като средни стойности. Анализираните средни стойности са показани като средна стойност ± SEM.

Дискусия

GDF15 нокаутиращите мишки не показват груби аномалии, което предполага, че GDF15 не е от съществено значение за поддържането на основните жизнени функции. Когато се поставят на обезогенна диета с високо съдържание на мазнини, мъжките нокаутиращи мишки GDF15 бързо наддават повече тегло от мишки от див тип и развиват влошен глюкозен толеранс, което предполага защитна роля на ендогенния GDF15 в отговор на състояния, предизвикващи затлъстяване. Енергийната хомеостаза се поддържа от баланса между енергийния прием и енергийните разходи. В сравнение с контролните животни от див тип, нокаутираните мишки GDF15 са имали по-висок прием на храна и по-ниска скорост на метаболизма, и двете вероятно са допринесли за влошеното развитие на затлъстяването. Общият разход на енергия е сумата от основния метаболизъм, индуцираното от храната производство на топлина, терморегулация и енергийни разходи, свързани с физическа активност. Тъй като нокаутиращите мишки GDF15 са имали по-ниска двигателна активност, намаляването на енергийните разходи, свързани с физическа активност, вероятно е фактор, допринасящ за по-ниската скорост на метаболизма. Остава обаче да се изясни дали дефицитът на GDF15 също влияе върху основния метаболизъм и терморегулацията.

В нашето проучване женските мишки показват много по-малко стабилен фенотип от мъжките мишки по много параметри. Съобщава се, че женските мишки са значително по-малко чувствителни от мъжките мишки към затлъстяване, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, инсулинова резистентност, системно възпаление и дефицит в обучението [28–31]. Предполагаме, че по-малко стабилният фенотип при женски нокаутиращи мишки GDF15 е резултат от това, че този модел е по-малко чувствителен към диета с високо съдържание на мазнини. Не е ясно защо женските мишки са по-малко чувствителни към диета с високо съдържание на мазнини, отколкото мъжките мишки. Но е известно, че хормоналните вариации, свързани с естрозния цикъл, засягат множество пътища, важни за енергийния баланс, а мъжкият е предпочитаният пол в метаболитните изследвания на гризачи [32–35]. Надеждният фенотип, наблюдаван при мъжки мишки, предполага, че ендогенният GDF15 е важен за защита срещу развитието на затлъстяване в обезогенна среда и ние предполагаме, че повишените нива на GDF15 при затлъстяване може да са резултат от отговор за преодоляване на резистентността към GDF15.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. GDF15 нокаутиращи мишки.

(А) PCR анализ на ушни проби от див тип, хетерозиготни, хомозиготни нокаутиращи мишки. (Б) Циркулиращи миши нива на GDF15 при диви и нокаутиращи мишки при нормална чау. (C) Циркулиращи миши нива на GDF15 при диви и нокаутиращи мишки на диета с високо съдържание на мазнини.