Ju Yup Lee

1 Отделения по вътрешни болести, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

възпалението

Наюнг Ким

1 Отделения по вътрешни болести, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

Ryoung Hee Nam

1 Отделения по вътрешни болести, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

Юн Чон Чой

1 отделения по вътрешни болести, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

Ji Hyung Seo

1 Отделения по вътрешни болести, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

Hye Seung Lee

2 отделения по патология, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

Джейн С. О

3 Клиника Yonsei Plus, Seongnam, Gyeonggi-do, Корея

Донг Хо Ли

1 Отделения по вътрешни болести, болница Bundang на Националния университет в Сеул, Seoungnam, Gyeonggi-do, Корея

Резюме

Заден план:

Предишни проучвания върху инфекция с Helicobacter pylori при мишки са допринесли за по-доброто разбиране на патогенезата на хроничния гастрит и стомашния карцином. Целта на това проучване е да се оцени колонизацията на H. pylori и последващите възпалителни реакции в стомаха на мишки C57BL/6 в зависимост от броя на инокулациите и наличието на диета с високо съдържание на сол.

Методи:

В това проучване са използвани осемдесет и четири женски мишки на възраст 4 седмици. Заразените мишки бяха обезвредени с щам H. pylori Sydney-1 (SS1) и неинфектираните мишки бяха дозирани с носител. Във всяка от тези групи половината от мишките са били хранени с основна диета (0,25% сол), а другата половина са били хранени с диета с високо съдържание на сол (7,5% сол). Заразените мишки бяха инокулирани 4 или 5 пъти и състоянието на инфекция и степента на възпаление бяха проверени съответно чрез култура и хистопатология след 4 седмици. Миелопероксидазата на стомашната лигавица и факторът на некроза на тумора-алфа бяха измерени чрез ELISA.

Резултати:

Общият процент на инфекция е 95,2%; степента на инфекция след 5 инокулации (100%) е по-голяма от тази след 4 инокулации (91,3%). Не са открити обаче разлики в степента на възпаление между 2 групи. Бактериалната плътност също се увеличава значително при мишки, които са били на диета с високо съдържание на сол и са били инокулирани съответно 5 пъти. Средната инфилтрация на неутрофили в заразената група е 1,7 ± 0,6 (1, минимална; 2, лека; 3, умерена; 4, маркирана). Диетата с високо съдържание на сол обаче не повишава степента на възпаление в заразената група. Нивата на миелопероксидаза на стомашната лигавица и фактор на некроза на тумора-алфа не се повишават с диета с високо съдържание на сол и увеличават броя на инокулациите.

Заключения:

Въпреки добре колонизирането на H. pylori в стомаха на мишки C57BL/6, степента на последващото възпаление е без значение за диетата с високо съдържание на сол и честите (5 пъти) инокулации.

ВЪВЕДЕНИЕ

Helicobacter pylori, грам-отрицателна бактерия, която колонизира стомашния епител, е основната причина за стомашната канцерогенеза и други стомашни заболявания като хроничен гастрит, гастродуоденални язви и лимфоидна тъканна лимфома на стомашната лигавица.1 H. pylori е класифициран като „Определен биологичен канцероген“ от Световната здравна организация (СЗО) през 1994 г. Инфекцията с H. pylori е изследвана при различни експериментални животни, за да се изяснят основните патологични и биохимични механизми.3 Моделът на мишката е най-добре установеният модел на животни и е първият животински модел на бактериален гастрит, за да покаже прогресията от остро към персистиращо хронично активно възпаление, както се наблюдава при инфекция с H. pylori при човека.4 По този начин този модел е използван за потвърждаване на отговора на гостоприемника, 5 за изследване на ефектите от фактори на околната среда като стомашни нива на киселина при колонизация на Helicobacter, 6 и за оценка на вирулентността на различни щамове на H. pylori. Освен това, моделът на мишката също допринесе за разработването на ваксини, които могат да се използват за предотвратяване на инфекция с H. pylori.7–9

Предлага се поглъщане на високо съдържание на сол, за да се увеличи рискът от рак на стомаха.10,11 Въпреки това, връзките между диетата с високо съдържание на сол и туморите на стомаха са по-малко последователни и рядко повишават коригираното съотношение на шансовете в епидемиологични проучвания при хора.12 Хипотезата, че поглъщането на високо съдържание на сол насърчава рак на стомаха остава противоречиво и СЗО заключава, че поглъщането на високо количество сол „вероятно ще увеличи риска от рак на стомаха.“ 2 Експериментални модели на мишки са използвани за оценка на връзката между приема на високо съдържание на сол и инфекцията с H. pylori .13,14 Въпреки това, предишните експериментални проучвания показват последователни резултати по отношение на ефекта на високосолената диета върху канцерогенезата чрез засилване на колонизацията и увеличаване на въздействието на хроничния гастрит на H. pylori.

Целта на това проучване е да се установи подходящ модел на мишка H. pylori и да се изясни дали диетата с високо съдържание на сол може да насърчи инфекцията с H. pylori.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. Животни

Триседмични женски мишки C57BL/6 (Orient Co., Ltd., Сеул, Корея) бяха настанени в клетка, поддържана при 23 ° C с 12/12-часов цикъл светлина/тъмнина при специфични условия, свободни от патогени. След 1 седмица адаптация за експериментите бяха използвани 4-седмични мишки с тегло 10–15 g. Всички експериментални процедури са одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните (IACUC) на болница Bundang в Националния университет в Сеул (IACUC номер: BA1004-059/016-01).

2. Култура и инокулация на H. pylori

Приспособеният към мишката H. pylori Sydney Щам 1 (SS1), установен от Lee et al. 16, беше използван за всички експерименти. Бактериите се отглеждат на инфузионен бульон мозък-сърце, допълнен с 5% конски серум в микроаерофилна атмосфера (5% O2; 10% CO2; 85% N2) при 37 ° C за 72 часа. Организмите са идентифицирани положително въз основа на морфологията и наличието на оксидаза, каталаза и уреаза. Мишките бяха инокулирани орогастрично с> 10 8 колониеобразуващи единици (CFU)/mL H. pylori SS1 (0,25 mL) през ден в продължение на 6-8 дни (общо 4 или 5 инокулации).

3. Експериментален дизайн (режим на хранене и бактериални инокулации)

В това проучване са използвани четириседмични женски мишки на 84 години. Заразените мишки (n = 56) бяха обезвредени с H. pylori SS1 и неинфектираните мишки (n = 28) бяха дозирани с носител. Мишките се дават с H. pylori SS1 или само с носител (0.25 mL) през ден за общо 4 или 5 пъти. След това мишките са били хранени или с основна диета (0,25% сол), или с високо съдържание на сол (7,5% сол), което води до следните 4 групи: (1) незаразени мишки, хранени с основна диета, (2) незаразени мишки, хранени на диета с високо съдържание на сол, (3) заразени с H. pylori мишки, хранени на базална диета, и (4) заразени с H. pylori мишки, хранени на диета с високо съдържание на сол. По време на периода на инокулация на H. pylori всички заразени мишки са хранени с основна диета и след това са преминали към диета с високо съдържание на сол. Всички мишки бяха умъртвени чрез вдишване на CO2 на 4 седмици след инокулацията (фиг. 1).

Схематично представяне на експерименталния дизайн.

4. Хистопатология

При некропсия, стомашната тъкан е взета от по-голямата кривина, започвайки от скуомоколумната връзка и завършваща при гастродуоденалната връзка. Линейните стомашни ленти бяха фиксирани в 10% разтвор на формалин, обработени по стандартни методи, вградени в парафин, разделени на 5 μm и оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). Стомашната лигавица е изследвана хистологично за възпалителни и епителни промени и за наличие на H. pylori. Степента на неутрофилна инфилтрация, мононуклеарна клетъчна инфилтрация, атрофия и метаплазия се оценява съгласно актуализираната класификация в Сидни, както следва: 0, отсъства; 1, минимално; 2, леко; 3, умерено; 4, маркирани.

5. Определението за успешен модел на мишка и инфекция с Helicobacter pylori

Успешен модел на мишка беше определен като такъв, при който всички мишки от H. pylori SS1-инокулираната група бяха положителни за (1) H. pylori, както се определя от H&E оцветяване, или (2) култура H. pylori, или (3) H индуциран от пилори гастрит в хистопатологията. Инфекцията с H. pylori се определя от наличието на H&E оцветяване или култура на H. pyloriin.

6. Измерване на лигавичната миелопероксидаза и тумор некрозис фактор алфа

Десет милиграма остъргана лигавица се хомогенизира в продължение на 30 секунди с хомогенизатор Polytron в 200 μL ледено буфер за лизис (200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris [pH 7.4], 10% глицерин, 1 mM PMSF, 1 μg/ml леупептин и 28 μg/ml апротинин). Клетъчните суспензии се центрофугират при 13 000 rpm в продължение на 15 минути и полученият супернатант се анализира с помощта на миелопероксидазен (MPO) ELISA комплект (HyCult Biotechnology, Uden, Холандия). За фактор на туморна некроза алфа (TNF-α) бяха използвани подходящите комплекти от R&D Systems (Минеаполис, MN, САЩ), следвайки инструкциите на производителя. Концентрацията на протеин беше измерена с помощта на Bio-Rad Protein Assay Kit (Bio-Rad Laboratories; Hercules, MA, USA). Концентрацията на всеки цитокин беше представена като пиктограми на милиграм протеин. Всички анализи бяха проведени в три екземпляра.

7. Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Сравнението на 2 групи беше извършено с помощта на U-теста на Mann-Whitney или точния тест на Fisher’s. Стойностите на P, по-малки от 0,05, се считат за статистическа значимост. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуер SPSS (версия 20.0; SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ).

РЕЗУЛТАТИ

1. Диетата с високо съдържание на сол повишава нивото на колонизация на Helicobacter pylori в количествената култура

Колонизация на Helicobacter pylori върху стомашната лигавица при мишки C57BL/6 (H&E оцветяване); × 200 (A), × 1000 (B). Спиралните бактерии са наблюдавани в стомашни ями на седмица 4 след инокулация (стрелка).

3. Високосолената диета и многократното инокулиране не повишават резултатите от възпалението

В хистопатологичните резултати, степента на неутрофил на мишките, хранени с диета с високо съдържание на сол, не се различава значително от тази на мишките, хранени на основна диета, както за незаразени, така и за заразени мишки (фиг. 4А). Въпреки това, степента на моноцитите е била по-ниска в заразената диетична група с високо съдържание на сол, отколкото в заразената, базална диета, въпреки че този резултат не е статистически значим (Фиг. 4В). Групата, която е била инокулирана 4 пъти, е имала леко повишена степен на неутрофил, въпреки че разликата не е била статистически значима (Фиг. 5А), а степента на моноцитите е била намалена при мишки, които са били инокулирани 5 пъти и хранени с диета с високо съдържание на сол. (Фиг. 5Б). В сравнение с хистологично нормални мишки (фиг. 6А), заразените с H. pylori мишки и при двете диети развиват хроничен активен гастрит с лигавична метаплазия (фиг. 6В-D).

Миелопероксидаза на стомашната лигавица (MPO, ng/mL) (A) и нива на фактор на туморна некроза алфа (TNFα, pg/mL) (B) според диетата, статус на инфекция с Helicobacter pylori (H. pylori) и брой инокулации. * P 7 CFU/ml може да се колонизира в 100% от стомаха на мишките, повечето предишни проучвания са инокулирали H. pylori SS1 за 3 пъти на интервали от 2 дни. 14,15,19–21 Въпреки това в настоящото проучване ние се опитахме да инокулираме H pylori 4 или 5 пъти за засилване на бактериалната колонизация и 5 пъти инокулация дават по-висока бактериална плътност от 3 или 4 пъти инокулация и скоростта на култивиране е повече от 90%, когато се инокулира 5 пъти. За да се докаже успешна инфекция, в това проучване е проведена култура на H. pylori от надраскания стомах на мишки и са установени задоволителни количества колонии. Въпреки това, като се има предвид възможността за неефективен растеж на H. pylori от друго замърсяване с микроорганизми или недостатъчен образец на лигавицата, беше направено допълнително H&E оцветяване. Положителна инфекция с H. pylori е потвърдена чрез използване на който и да е от тези 2 метода и е установено, че степента на инфекция е съответно 91,3% и 100% в 4 и 5 пъти инокулирана група, съответно.

Силните страни на това проучване са следните: чрез дълъг период, включващ предварителни проучвания, бяха оценени различни състояния и успяхме да намерим най-доброто състояние на възпаление. Друга силна страна е класификацията на миши гастрит, предизвикан от H. pylori с актуализирана система в Сидни от опитен патолог.

В заключение беше установено, че H. pylori е относително добре колонизиран в стомаха на мишки C57BL/6, но възпалението не се влошава въпреки използването на различни методи като прилагане на диета с високо съдържание на сол или увеличаване на броя на инокулациите . За да се разработят методи за повишаване нивото на стомашно възпаление, се планират по-нататъшни опити за този миши модел на инфекция с H. pylori.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена с грант № 06-2011-167 от Фонда за изследвания на болницата в Националния университет в Сеул Bundang.