Лаборатория по молекулярна вирусология и онкология, Фондация Франческо Балсано, Рим, Италия, Институт по молекулярна биология и патология, Национален изследователски съвет, Рим, Италия

нормокалоричната

Свързана лаборатория по молекулярна вирусология и онкология, Фондация Франческо Балсано, Рим, Италия

Отделение за предсказуема медицина на принадлежност, Университет Сапиенца, Рим, Италия

Отдел за обществено здраве и инфекциозни болести, Университет Сапиенца, Рим, Италия

Отделение за предсказуема медицина на принадлежност, Университет Сапиенца, Рим, Италия

Свързана лаборатория по молекулярна вирусология и онкология, Фондация Франческо Балсано, Рим, Италия

Свързана лаборатория по молекулярна вирусология и онкология, Фондация Франческо Балсано, Рим, Италия

Отделение за обществено здраве и инфекциозни болести, Университет Сапиенца, Рим, Италия

Лаборатория по молекулярна вирусология и онкология, Фондация Франческо Балсано, Рим, Италия, Институт по молекулярна биология и патология, Национален изследователски съвет, Рим, Италия

  • Роберта Маджо,
  • Кармела Вискоми,
  • Паола Андреоци,
  • Габриела Д'Етор,
  • Джовани Вискоглиози,
  • Барбара Барбаро,
  • Мануеле Гори,
  • Винченцо Вуло,
  • Клара Балсано

Фигури

Резюме

Пробна регистрация

Цитат: Maggio R, Viscomi C, Andreozzi P, D'Ettorre G, Viscogliosi G, Barbaro B, et al. (2014) Нормокалоричната диета с нисък холестерол модулира баланса Th17/Treg при пациенти с хронична вирусна инфекция с хепатит С. PLoS ONE 9 (12): e112346. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0112346

Редактор: Салваторе Петта, Университет дели Студи ди Палермо, Италия

Получено: 5 май 2014 г .; Прието: 1 октомври 2014 г .; Публикувано: 22 декември 2014 г.

Наличност на данни: Авторите потвърждават, че всички данни, лежащи в основата на констатациите, са напълно достъпни без ограничения. Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Този проект беше подкрепен от безвъзмездни средства, получени от: Министерство на образованието, университета и научните изследвания (MIUR) - Изследователски проекти от национален интерес (PRIN) (prot. 2009, YNERCE); MIUR- Фонд за инвестиции в основни изследвания (FIRB) (prot. 2010, RBAP10A9H9); MIUR-FIRB (prot. 2010, RBAP10TPXK). По-специално, стипендията на Р. Маджо беше подкрепена от Фондация Умберто Веронези. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Инфекцията с вируса на хепатит С (HCV) засяга около 170 милиона души по целия свят; острата фаза на инфекцията рядко се изчиства и повечето пациенти се заразяват хронично. Хроничната инфекция с HCV често се характеризира с нарушения на липидния метаболизъм, които водят до чернодробна стеатоза [1]. В допълнение, липидният метаболизъм и холестеролът имат ключова роля във вирусния жизнен цикъл [2]. По-специално, холестеролът в плазмената мембрана е необходим за навлизане на HCV [3]; освен това HCV репликацията се осъществява в домени, богати на холестерол, в комплекса на вирусната репликация [4]. Наскоро по-високият прием на холестерол в храната се свързва с прогресията на прогресията на свързаното с HCV прогресия на черния дроб [5]. Следователно, диетичната модулация на приема на холестерол може да представлява иновативна стратегия за намаляване на прогресията на HCV инфекцията.

Освен това, последните проучвания подчертават, че Th17 клетъчната диференциация може да се регулира от LXRs на ядрените рецептори (Liver X Receptors), известни като LXRα и LXRβ [20], [21]. Тези ядрени рецептори действат като важни модулатори на липидния метаболизъм и хомеостазата на холестерола чрез регулиране на гени, като SREBP-1c (протеин, свързващ стерол регулаторен елемент 1c), и ABCA-1 (ATP-свързващ касетен транспортер-1) [22]. Следователно, като се има предвид значението на холестерола за жизнения цикъл на HCV [2] и участието на LXR в модулацията на имунния отговор, ние си помислихме, че холестеролът [23], [24], чрез LXRs-медиирано сигнализиране [23] ], [24], може да представлява ключов елемент в регулирането на диференциацията на Т лимфоцитите в Th17 клетките. В допълнение, пациентите със СНС имат високи серумни нива на оксистероли, ендогенни лиганди на LXR и продукти на окисление на холестерола [25]. Освен това се съобщава за пряко взаимодействие между HCV-ядрен протеин и Retinoid X Receptor (RXR) алфа [26], [27], добре познат хетеродимерен партньор на LXR. Така че RXR/HCV-ядрен комплекс може да дерегулира LXRs активността по време на HCV инфекция, подкрепяйки влиянието на HCV върху LXR и от своя страна върху честотата на Th17 клетките, като по този начин потенциално засяга имунната система на гостоприемника.

На тези основи направихме пилотно проучване, за да проучим дали нормалнокалоричната диета с нисък холестерол (NLCD) може да модулира баланса Th17/Treg при пациенти, засегнати от хронична HCV инфекция. С тази експериментална обстановка директно сравнихме ефекта на NLCD при пациенти с СНС в сравнение с неалкохолна мастна чернодробна болест (NAFLD) и пациенти с алкохолен стеатохепатит (NASH), тъй като последните две категории пациенти се характеризират както с чернодробна стеатоза, така и с липидни нарушения [ 28], подобно на наблюдаваните при пациенти с СНС, но при липса на вирусно участие.

Пациенти и методи

Декларация за етика

Протоколът за това изпитание и подкрепящият контролен списък са на разположение като допълнителна информация; вижте контролен списък S1 CONSORT и протокол S1. Изследването е одобрено от местния комитет по етика на университета Сапиенца, Рим, Италия, (номер на одобрение: 2534; на 26 юли 2012 г.) и се провежда съгласно принципите, изразени в Декларацията от Хелзинки. Опитът е регистриран на ClinicalTrials.gov (регистрационен номер: NCT02038387). Това проучване е записано след започване на записването на участниците, тъй като това е чисто наблюдателно проучване, което не включва прилагане на лекарства; по този начин, на първо място, не сметнахме за необходимо да го запишем на ClinicalTrials.gov. Освен това, ние се придържахме точно към процедурите, одобрени от Комитета по институционална етика на 26 юли 2012 г., които са получени преди началото на процеса. Първото набиране на пациент е извършено през 2013 г., а набирането на нови пациенти все още продължава. Авторите потвърждават, че всички текущи и свързани с тях опити за тази интервенция са регистрирани. За всеки пациент продължителността на проследяване е 30 дни. Всички участници дадоха писмено информирано съгласие.

Пациенти

Тридесет пациенти с CHC и 30 пациенти с NAFLD/NASH, диагностицирани с ултразвук [29] [7% от тях са доказали NASH чрез биопсия], са подложени на диетичен режим (Фиг. 1). Нито един пациент не е получавал никакво фармакологично лечение поне 6 месеца преди постъпване в проучването, по-специално лекарства, потенциално повлияващи метаболизма на холестерола (например статини, фитостероли и др.). Изключихме пациенти с цироза. Други критерии за изключване бяха, както следва: коинфекция от вируса на хепатит В или инфекции с вируса на човешкия имунодефицит, автоимунни заболявания и други съответни свързани заболявания като декомпенсиран диабет, бъбречни заболявания, белодробни заболявания, тумори.

Пациентите са инструктирани да спазват нормалнокалорична диета с нисък холестерол (1400 Kcal за жени и 1800 Kcal за мъже) за период от 30 дни. Диетичните съединения бяха разпределени както следва: липиди 23% (холестерол 185 mg/ден), въглехидрати 50% и протеини 27%. Приемът на сол е поддържан до това, което пациентите са имали преди, за да не влияят върху честотата на Th17 клетките въз основа на съдържанието на сол [30].

Диетичните навици преди проучването са регистрирани за всички записани пациенти, без да се установят значителни разлики в приема на хранителни вещества между пациентите с СНС и контролната група (NAFLD/NASH пациенти).

Пациентите бяха инструктирани да следват същата рецепта за приготвяне на храна. Диетата е осигурена от експерт диетолог. Спазването на диетата се наблюдава чрез телефонно интервю със седмична честота. Субектите бяха посъветвани да поддържат нормалната си жизнена активност и режим на сън по време на интервенционния период. Субектите са инструктирани да спазват диетата в деня след измерванията на изходното ниво (ден 1). В началото (ден 0, а именно Т0) и края (ден 30, а именно Т30) на диетата, кръвните проби бяха анализирани за общи параметри, включително биохимични параметри, хематология и стойности на коагулацията (Таблица 1). NLCD не се осигурява за намаляване на теглото на пациента, а по-скоро за въздействие върху активността на вируса, за която е известно, че зависи от холестерола.

Изолация и стимулация на клетките

На ден 0 и ден 30, мононуклеарни клетки от периферна кръв (PBMC) бяха изолирани от хепаринизирани кръвни проби чрез центрофугиране с градиент на плътност на Ficoll-Hypaque (Eurobio, Les UlisCedex, Франция). Мононуклеарните клетки бяха ресуспендирани в RPMI (Cambrex BioScience, Verviers, Белгия), завършени с 10% топлинно инактивиран фетален телешки серум (FCS, HyClone, South Logan, UT) и 1% глутамин (всички от Euroclone, Милано, Италия), и наляво стимулиран с 50 ng/ml Phorbol Myristate Acetate (PMA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 1 µg/ml йономицин (Iono, Sigma-Aldrich). Стимулирането се извършва при 37 ° С в продължение на 5 часа, в присъствието на интрабиторния инхибитор на трафика Brefeldin A (10 µg/ml BFA; Sigma-Aldrich), преди вътреклетъчно оцветяване и цитофлуориметричен анализ.

Вътреклетъчно оцветяване и многопараметричен цитофлуориметричен анализ

След стимулация клетките се измиват два пъти в безцветен с фосфат буфериран физиологичен разтвор (PBS, Cambrex BioScience) и след това се третират с помощта на Fix и Perm клетъчен пермеабилизационен комплект (Caltag Laboratories, Burlingame, CA), според инструкции на производителя. За изследване на Th17-клетки, PBMC бяха първо оцветени на повърхността с конюгирани с флуорохром анти-CD161, CD3, CD4 и контролни mAb, съвпадащи с изотипа, бяха закупени от BD Biosciences (Сан Хосе, Калифорния, САЩ), за 20 минути при 4 ° ° С. След това клетките бяха фиксирани и проникнати и оцветени вътреклетъчно с конюгиран с фикоеритрин (РЕ) анти-IL-17A и анти-IL-22 PE (всички eBioscience, Сан Диего, Калифорния, САЩ).

За изследване на Treg-клетки, PBMC първо се оцветяват с конюгирани с флуоресцеин изотиоцианат (FITC) анти-човешки CD4 антитела, конюгирани с Alex Fluor 647 анти-човешки CD127 антитела, конюгирани анти-човешки CD3 антитела срещу перидинин хлорофил и конюгирани с алофикоцианин (APC) анти-човешки CD25 антитела в продължение на 30 минути, след това се лизират с FACSTM лизиращ разтвор (BD PharMingen, Сан Хосе, Калифорния) и се третират със смес за фиксиране/къдрене, съгласно инструкциите на производителя. И накрая, клетките бяха инкубирани с PE-конюгирани анти-човешки антитела Foxp3 за една нощ. Използвани са изотопни контроли, за да се осигури специфичност на антителата.

Оцветените клетки бяха получени с поточен цитометър LSR Fortessa (Becton Dickinson) и анализирани с FACSDiva софтуер (BD Biosciences) или FlowJo софтуер (Treestar, Ashland, OR). Регионът на лимфоцитите е дефиниран въз основа на физически параметри на разсейване напред и странично; Подгрупите на T хелпер и Treg клетки бяха идентифицирани чрез оцветяване срещу CD3 и anti-CD4. Пробите бяха затворени на живи, единични CD3 + Т лимфоцити.

QPCR в реално време

Обща РНК е изолирана от PBMC на пациентите с помощта на реактива Trizol (Invitrogen, от Life Technologies) и са приготвени 2 µg комплементарна ДНК с използване на Random Primers и AMV Reverse Transcriptase of the Reverse Transcription System (A3500, Promega) според производителя протокол. PCR праймерите са проектирани с помощта на софтуер AmplifX 1.5.4 и NCBI Primer-BLAST и са както следва: човешки LXRα, напред 5′-TGCCGAGTTTGCCTTGCTCATT-3 ′ и обратен 5′-GGAGGCTCACCAGTTTCATTAGCA-3 ′; човешки LXRβ напред 5′-AAGAAGGGCCCAGCCCCGAA-3 'и обратен 5′-ACACTGCGCCGGAAGAAGCC-3'; човешки SREBP-1c, напред 5′-TTCCGCCCTTGAGCTGCGTG-3 ′ и обратен 5′-CCGGAAGCTCTGTGCCAGCC-3 ′; човешки ABCA-1, напред 5′-CTGGGCCACAATGGAGCG-3 ′ и обратен 5′-ATGTAGGCGGTGCCCGAGGT-3 ′. Праймерите за β-актин бяха използвани като контрол на домакинството: човешки β-актин, преден 5′-GCACTCTTCCAGCCTTCC-3 ′ и обратен 5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCAC-3 ′. QRT-PCR се извършва с 7500 PCR в реално време PCR система (Applied Biosystems, CA, USA), използвайки Power SYBR Green PCR Master Mix като флуорофор, включително ROX като пасивна референция (Applied Biosystems). Всички PCR условия и праймери бяха оптимизирани за получаване на единичен продукт с очаквания размер на основната двойка. Всички експерименти бяха проведени в три екземпляра.

Имуносорбентен анализ, свързан с ензими (ELISA)

Серумната концентрация на IL-17, IL-22, IL-23 (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) и TGF-β (eBioscience) се измерва чрез налични в търговската мрежа комплекти ELISA, съгласно протоколите, предоставени от производителя. За да определим серумното ниво на хиалуроновата киселина (HA), използвахме количествен комплект за тест (Corgenix, Denver, CO). Всички проби бяха оценени в три екземпляра.

Статистически анализ

Резултатите се изразяват като средни стойности ± стандартно отклонение (SD) за необработени данни и като проценти ± SD. Извършихме сдвоен студентски t-тест, сравняващ T30 спрямо T0 времевата точка в същата група анализирани пациенти. Анализът на корелацията се извършва с помощта на корелационен тест на Пиърсън. Размерът на пробата е определен въз основа на неотдавнашни проучвания [7], [14], [15], подкрепящи хипотезата, че честотата на клетките Th17, променливата в нашата кохорта от пациенти, вероятно е средно 3,2% ± 2,0. Ние предположихме, че диетата може да намали Th17 клетъчната честота до 2,0% ± 0,15, мощност = 90%, ниво на значимост = 0,05; поради тази причина за извършване на проучването са необходими поне 24 пациенти на група. По този начин включихме 30 пациенти на група, като се има предвид възможното отпадане на около 20% от тях. Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на софтуер PRISM v.5 (GraphPad Software, Сан Диего, Калифорния); p-стойност + CD4 + Т клетки, дефинирани като Th17 клетки

Първо, ние изследвахме процента на Th17 клетки в периферната кръв на пациенти с CHC и NAFLD/NASH. Нашите експерименти демонстрираха и потвърдиха значително увеличаване на честотата на IL-17- и IL-22-секретиращи Th17 клетки при пациенти с CHC и NAFLD/NASH в сравнение със здрави донори [13] - [15] (данните не са показани).

След 30 дни NLCD, при пациенти с СНС открихме статистически значимо намаляване на честотата на Th-клетки, продуциращи IL-17- и IL-22 (Фиг. 2А). В противен случай при пациенти с NAFLD/NASH не установихме значителна разлика в честотата на Th17-клетките преди и след диета (фиг. 2В). Свързаните с Th17 цитокини също са изследвани преди и след диета в серума на двете групи пациенти. Серумните нива на IL-17 и IL-22 са значително намалени само при пациенти с СНС (фиг. 2С). Същата тенденция след диета, която наблюдавахме за серумните нива на свързани с Th17 цитокини, дори ако не беше достигната статистическа значимост (Фиг. 2С).

А) Преди (T0) и след (T30) NLCD, при пациенти с СНС, наблюдаваме статистически значимо намаляване на IL-17- и IL-22-продуциращите клетки сред посочените CD161 + CD4 + T фракции и затворени живи CD4 + CD3 + лимфоцити. Б) Тези промени в честотата на IL-17 + и IL-22 + Th17 клетките не достигат статистическа значимост преди (T0) и след (T30) NLCD при пациенти с NAFLD/NASH. В) След диета при пациенти с CHC и NAFLD/NASH, наблюдавахме същата тенденция на серумните нива на IL-17 и IL-22, дори ако не беше постигната статистическа значимост при пациенти с NAFLD/NASH. Показан е един представителен сюжет на всички независими експерименти. * Експресиране на P + CD3 + Т лимфоцити, ниски нива на CD127 и високи нива на CD25 заедно с виличната кутия/крилат транскрипционен фактор P3 (FoxP3). По този начин в лимфогатните CD3 + CD4 + клетки бяха открити Treg клетките чрез комбинация от CD25 + CD127low/- и FOXP3 + [31]. Процентът на тази циркулираща клетъчна популация е довел до по-висок при пациенти със СНС след NLCD (фиг. 3А), което е довело до значително подобрение в съотношението Treg/Th17 (p Фигура 3. Промяна на честотата на Treg-клетките и съотношението Treg/Th17 в Пациенти с NAFLD/NASH и CHC, преди и след NLCD.

Оценката на Treg клетки чрез поточна цитометрия беше определена като процент на CD127 ниски/-CD25 + FoxP3 + клетки в CD3 + CD4 + отделението. Ние докладвахме точковите графики на представителни експерименти, с процента на CD25 + CD4 + Treg клетки, които CD25 + са CD127 ниски или отрицателни, и процента на CD4 + CD25 + CD127 нисък/-FOXP3 + Treg клетки преди и след NLCD в периферна кръв на CHC (A) и NAFLD/NASH пациенти (B). В таблицата отчитаме статистически значима разлика между T0 и T30 в честотата на Treg-клетки при СНС, но не и при пациенти с NAFLD/NASH. В C) Представяме промените в съотношението между CD4 + CD25 + CD127low/-FOXP3 + Treg и Th17 (IL-17 + CD161 + CD4 + T) честотите на клетките, получени от двете групи, изследвани преди и след NLCD. Хоризонталните ленти представляват средните стойности на посочения индекс. * P Фигура 4. Относителна експресия на иРНК на LXRs и свързан ген, получен от PBMCs на NAFLD/NASH и CHC пациенти, след NLCD.

При пациенти с СНС след NLCD наблюдаваме много значими промени в нивата на LXRα, LXRβ и ABCA-1 иРНК по отношение на преди NLCD (A). Не са наблюдавани значителни промени при пациенти с NAFLD/NASH след NLCD (B). Данните са изразени като средно ± SD; всички проби бяха оценени в три екземпляра. Лентите за грешки илюстрират SD. * P Фигура 5. Серумни нива на (A) TGF-β, HA и (B) IL-23, получени от пациенти с NAFLD/NASH и CHC преди и след NLCD.