Субекти

Резюме

Въведение

Начин за справяне с това е да се изследва как се променят чернодробните липиди след обръщане на глюкозната непоносимост и инсулинова резистентност. При хора с T2D е ясно, че гликемичният контрол може бързо да се нормализира чрез бариатрична хирургия 20,21 или диети с много ниска енергия 22,23,24,25,26, като голяма част от това е чернодробно медиирано 20,22,23, 24,26. Основните отговорни механизми обаче са неясни. Докато подобряването на метаболизма на чернодробната глюкоза в отговор на ограничаването на енергията е свързано с намален чернодробен TAG 23, малко се знае за ефектите върху биоактивни липиди като DAG, поради трудностите при получаване на човешки чернодробни проби. Нашите предишни проучвания при мишки 14 показаха, че чернодробната инсулинова резистентност е най-ранната метаболитна проява на диета с високо съдържание на мазнини и високо захароза (HFD), която е свързана с извънматочно натрупване на липиди, но не и възпаление на чернодробната или мастната тъкан. В светлината на тези проучвания, ние имахме за цел да проведем цялостен анализ на липидния и глюкозния метаболизъм при мишки, които са претърпели остър превключване от HFD обратно към стандартна чау диета, за да се определи по-добре връзката между чернодробния липиден метаболизъм и глюкозната хомеостаза.

диета

Експериментални процедури

Уча дизайн

На 42-ия ден, след 5 часа бързо, кръв (

30 μL) се получава от опашната вена за определяне на глюкоза, плазмен инсулин и FFA. Глюкоза (50 mg) се прилага през орален сондаж и кръв, получена след 15, 30, 45, 60, 90 и 120 минути. На 63 ден беше извършен стабилен изотоп, белязан OGTT 27. Прилагането на изотопно маркирана глюкоза осигурява оценка на динамичното изхвърляне на глюкоза, модела на ендогенно производство на глюкоза (EGP) и безсмисленото чернодробно глюкозно циклиране 27. Глюкозата беше измерена с глюкометър (Accu-Check, Roche, NSW, Австралия) и обогатяване на плазмен индикатор, измерено чрез газова хроматография-масова спектрометрия (GC-MS) 27 .

Определяне на източниците на EGP

В 17:00 ч. На ден 64 мишките получиха интраперитонеална инжекция от 2 H2O (30 ml/kg, Sigma, Castle Hill, NSW, Австралия), съдържаща 0,9% (w/v) NaCl. Мишките бяха поддържани с питейна вода, обогатена с 10% 2 H2O за една нощ, което постигна обогатяване на водата в тялото

5%. На следващата сутрин кръв (

50 μL) е получено след 5 часа бързо за определяне на 2 Н етикетиране на вода в тялото, както и позиционно обогатяване на 2 Н в плазмена глюкоза чрез GC-MS, което позволява да се разреши делът на глюкозата, произведена от глюконеогенеза (GNG) и гликогенолиза 27,28 .

Липиден метаболизъм

TAG се определя с помощта на колориметричен анализ (триглицериди GPOPAP; Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). DAG и керамидът бяха извлечени от

15 mg черен дроб, както е описано в 29 и анализирано, както е подробно описано в метода LC-MS/MS в Weir и др. 30. Синтез на глицеролипиди и de novo липогенеза (DNL) се измерват, като се използва 2 H2O маркиране. По-конкретно, глицеролипидният синтез се определя чрез измерване на 2 Н включване в глицеридната глицеролова част на чернодробния глицеролипиден пул 31, докато DNL се измерва чрез определяне на включването на 2 Н в общия палмитат 32,33. Маркирането с палмитат се използва за измервания на DNL, ​​тъй като е основният продукт на реакцията на синтаза на мастни киселини при бозайници, като маркирането на мастни киселини с дължина> 16 въглерода е резултат от удължаване на веригата, а не DNL 33,34. Екстракция на липиди на

Проведени са 15 mg предварително претеглена чернодробна тъкан съгласно методите на Folch 35 с добавяне на [U-13 C] палмитат (Cambridge Isotopes) като вътрешен стандарт, който позволява количествено определяне на общия палмитат 35. Липидната фракция се трансестерифицира чрез добавяне на 3 N метанолна HCI (Sigma, Castle Hill, Австралия) и се инкубира при 60 ° С за 1 h. Глицеролът се отделя от метиловите естери на мастните киселини (FAME) чрез Folch екстракция 35. Водната фаза, съдържаща глицерол, беше изсушена и дериватизирана чрез добавяне на MTBSTFA + 1% t-BDMCS (Sigma-Aldrich) и пробите бяха анализирани с помощта на електронна йонизация GC-MS. По-конкретно, молекулните [M-57] йони на m/z 377 и 378 бяха анализирани в SIM режим. FAME, съдържаща липидна фракция, беше изсушена и ресуспендирана в хексан. Молекулните йони на m/z 270, 271 и 286 ([U-13 С] палмитат вътрешен стандарт) на метилпалмитат се анализират в режим SIM чрез GC-MS. Синтезът на глицеролипиди и DNL се изчисляват съгласно уравнението за съотношение на етикетиране на прекурсорния продукт:

Етикетирането на продукта се отнася до излишък от моларно обогатяване на 2 Н с глицерол или палмитат, етикетиране на прекурсора = обогатяване с вода с 2 Н (плазма) и н = броят на сменяемите водородни атоми, който е определен

4.5 за чернодробния глицерид глицерол 31 и

22 за чернодробен палмитат 32,33. Абсолютните количества синтезиран продукт бяха изчислени чрез умножаване на фракцията на новоизработения продукт по абсолютната концентрация на продукта. Коригирането на изотопното изобилие на фона беше извършено чрез изваждане на обогатяването на проби, третирани с 2 H2O, от тези на проби от черен дроб на мишка, които не са изложени на 2 H2O.

Чернодробни метаболити

Метаболитите се екстрахират и анализират с GC-MS 36,37. Гликогенът беше измерен в KOH дигести, подложени на ензимна хидролиза, последвано от количествено определяне на свободни глюкозилни единици чрез анализ на глюкозна оксидаза.

Анализ на плазмата

Плазменият инсулин и лептин се измерват чрез ELISA (Millipore, St Louis, MO, USA). Плазмените FFA са измервани спектрофотометрично чрез ензимен колориметричен анализ (NEFA C Kit; Wako Chemicals, Richmond, VA, USA).

Статистика

Данните са представени като средно ± SEM. Данните бяха анализирани чрез еднопосочен ANOVA или двупосочни повтарящи се измервания ANOVA, където е подходящо. За еднопосочен ANOVA са използвани тестове за многократно сравнение на Newman-Keuls, за да се установят разлики между групите. За двупосочни повторни измервания ANOVA бяха използвани тестове за множество сравнения на Holm-Sidak, за да се определят разликите между групите. Статистическата значимост е определена на p

Резултати

Прием на енергия и телесна маса

През първите 56 дни групите HFD и HFD → CHOW консумират повече енергия от групата CHOW (Фиг. 1А). От 57 до 65 ден (т.е. обръщане на диетата), енергийният прием е намален при HFD → CHOW (Фиг. 1А). Телесната маса не се различава на изходно ниво между групите (фиг. 1В). Въпреки това, както HFD, така и HFD → CHOW групите са натрупали повече телесна маса от мишките CHOW за 56-дневния HFD период. На 65-ия ден, 9 дни след обръщане на диетата, HFD → CHOW мишките отслабват, но не са значително по-леки от HFD мишките и остават по-тежки от CHOW групата (Фиг. 1В). Епидидималните и подкожните (фиг. 1C, D) мастни подложки са по-тежки при HFD в сравнение с мишките CHOW и HFD → CHOW, докато масата на мастните възглавници остава повишена при HFD → CHOW в сравнение с групата CHOW (фиг. 1C, D). Плазменът лептин следва подобен модел (фиг. 1Е). Няма разлики в масата на квадрицепсите между групите (Фиг. 1F), което показва, че загубата на тегло при HFD → CHOW мишки се дължи на загуба на мазнини, а не на мускулна маса.

Ефекти от диетата върху енергийния прием и телесната маса.

Метаболизъм на глюкозата

Ефекти от диетата върху глюкозния толеранс.

Ефекти от диетата върху ендогенната глюкоза, изхвърлянето на глюкоза и източниците на EGP.

Чернодробни метаболити

Извършено е целенасочено профилиране, за да се анализират метаболитите в гликолитичния/GNG път, както и TCA цикълът (Фиг. 4А). Гликолитичните метаболити глюкоза-6-фосфат (G6P), фруктоза-6-фосфат (F6P), глицерол-3-фосфат (G3P) и фосфенолпируват (PEP), заедно с гликолитично получената аминокиселина серин са редуцирани при HFD мишки ( Фиг. 4А). HFD причинява намаляване на аденозин монофосфата (AMP; Фиг. 4В), което показва повишено чернодробно енергийно състояние. Тези метаболити бяха или частично (G6P, F6P, PEP и AMP) или напълно възстановени (G3P и серин) до нивата, открити в черния дроб на мишките CHOW след преминаване от HFD обратно към чау (фиг. 4А). Не са открити разлики в глицин, рибулоза-5-фосфат (Ru5P), рибоза-5-фосфат (R5P), лактат или аланин (фиг. 4А). Цитратът е намален в групата с HFD в сравнение както с групите CHOW, така и с HFD → CHOW (фиг. 4В), докато фумаратът и малатът са повишени в мишките HFD → CHOW в сравнение с групите CHOW и HFD (фиг. 4В). Сукцинатът, глутаматът и аспартатът не се различават между групите (фиг. 4В). Както се очаква, концентрацията на чернодробна свободна глюкоза (фиг. 4А) отразява тази на концентрацията на глюкоза на гладно (фиг. 2D), така че тя е повишена при HFD мишки и е нормализирана до тази на групата CHOW след диетично превключване.

Метаболомично профилиране на черния дроб.

Чернодробен липиден метаболизъм

HFD причинява повишаване на чернодробните TAG и DAG (фиг. 5А, В). Преминаването към диета с чау намалява TAG и DAG при мишките HFD → CHOW, така че те не се различават статистически от тези в групата CHOW (Фиг. 5А, В). Въпреки това, макар и да не са статистически различни, TAG и DAG все още са

2 пъти по-висока в групата за обръщане на диетата в сравнение с ЧОУ (фиг. 5А, В). В допълнение, редица видове DAG бяха увеличени при HFD мишките (Фиг. 4В), докато имаше силна тенденция те да бъдат намалени с преминаването към диета с чау. Общият церамид не се променя чрез диета (фиг. 5С), но се установяват ефекти върху отделните видове, че HFD увеличава церамида 20: 0, докато керамидът 24: 1 е намален (фиг. 5С). Интересното е, че церамид 18: 0, 20: 0 и 22: 0 са били повишени в групата HFD → CHOW в сравнение с мишките CHOW (фиг. 5С). За да се изследват механизмите, отговорни за намаляването на чернодробните липиди при HFD → CHOW мишките, ние оценихме чернодробния глицеролипиден синтез и DNL, ​​използвайки маркиране с 2 H2O. Абсолютното количество новосинтезиран глицеролипид е по-високо в групата на HFD в сравнение с групите HFD → CHOW и CHOW (Фиг. 5D). Общите нива на чернодробния палмитат бяха повишени при HFD мишките, докато преминаването към CHOW частично нормализира съдържанието на чернодробен палмитат (Фиг. 5Е). Абсолютното количество новосинтезиран палмитат (DNL) не се различава между групите CHOW и HFD (фиг. 5F). Въпреки това, DNL е по-нисък при HFD → CHOW мишките в сравнение с тези в CHOW и HFD групите (Фиг. 5F).

Ефекти от диетата върху липидния метаболизъм в черния дроб.

Дискусия

Ние показваме, че бързото намаляване на доброволния енергиен прием, в резултат на преминаването на HFD мишки обратно към чау диета, напълно нормализира непоносимостта към глюкоза, хипергликемията на гладно и хиперинсулинемията само след 7 дни. Интересното е, че както при хората 20,22,23,24,26 при хората, това се е случило, въпреки че е имало само умерено намаляване на телесното тегло и масата на мастните накладки. Освен това, въпреки бързото подобряване на хомеостазата на глюкозата при мишките с диверсия, липидите на черния дроб не са напълно нормализирани и остават

2 пъти по-високи от тези в групата CHOW. Заедно тези открития предполагат, че повишеното затлъстяване и повишените чернодробни липиди не са задължително включени в поддържането на инсулинорезистентно и непоносимо към глюкоза състояние и че острите промени в енергийния баланс вероятно ще играят по-важна роля за модулирането на глюкозната хомеостаза.

Също така използвахме маркиране на 2 H2O 39, за да изследваме приноса на GNG и гликогенолизата към EGP. Въпреки че HFD мишките показват хипергликемия на гладно и непоносимост към глюкоза, зависимостта от GNG и гликогенолиза не е променена. Освен това, тези потоци не са били засегнати при мишките за обръщане на диетата. Въпреки че тези резултати могат да изглеждат неочаквани, повишаване на фракционните или абсолютни нива на GNG се наблюдава само при силно хипергликемични пациенти с дефицит на инсулин, за преглед вж. 39. Следователно не е изненадващо, че GNG не е бил повишен при HFD мишките, тъй като те не са явно T2D и инсулинопенични, а по-скоро това е модел на преддиабет, характеризиращ се с инсулинова резистентност и хиперинсулинемия 2. В съответствие с нашите предишни констатации 27 и тези на други 40, ние показваме, че GNG отчита

80% от EGP при остро гладуващи мишки, отразяващи изключително високата скорост на метаболизма на тези животни 2. По този начин, противно на широко разпространеното мнение, зависимостта от GNG не се увеличава при HFD мишки и като се има предвид, че ние 14 и други 41 показахме, че базалният EGP не е повишен при гризани с мазнини, абсолютните нива на GNG не биха се увеличили с HFD.

Предишни проучвания при мишки също показват пълно или почти пълно нормализиране на глюкозната хомеостаза при HFD мишки, когато се върнат към ad libitum чау диета 42,43,44. Важно е обаче да се подчертае, че тези проучвания са използвали по-дългосрочни периоди на обръщане на диетата между две седмици и четири месеца 42,43,44,45. Интересното е, че само едно проучване извършва биохимични измервания, специфични за даден орган 43. Ли и др. 43 установи, че при мишки, хранени с HFD в продължение на 20 седмици, три седмици CHOW хранене водят до подобряване на толерантността към глюкозата и причиняват почти пълно нормализиране на чернодробните TAG и DAG. За разлика от това установихме, че чернодробните TAG и DAG са намалени с

50% с превключване от HFD към CHOW. Въпреки че съдържанието на TAG и DAG не се различава статистически между групите CHOW и обръщане на диетата, нивата им остават

2 пъти по-високо. Несъответствията между проучванията вероятно се дължат на факта, че диетичният период на обръщане, използван в настоящото проучване, е бил по-кратък от този, използван от Li и др. 43 (т.е. 9 дни срещу 3 седмици). Независимо от това, въпреки че чернодробните TAG и DAG бяха нормализирани само частично с обратното хранене, имаше пълно възстановяване на глюкозната хомеостаза. Това предполага, че връзката между чернодробните глицеролипиди и хомеостазата на глюкозата е сложна и вместо да е линейна, може да има праг, при който по-високите нива на TAG и DAG да влошат системния метаболизъм на глюкозата.

В съответствие с нашите предишни констатации 14,27, ние не наблюдаваме промяна в общото съдържание на чернодробен керамид с HFD. Интересното е, че при анализ на отделните видове стана очевидно, че HFD причинява увеличение на церамид 20: 0, докато церамид 24: 1 е намален. За наша изненада, всички керамиди 18: 0, 20: 0 и 22: 0 бяха повишени при мишките за обръщане на диетата в сравнение с групата CHOW. По този начин, за разлика от еднородните промени, наблюдавани при чернодробните TAG и DAG, ние откриваме малка връзка между чернодробния керамид и глюкозната хомеостаза, затлъстяването или чернодробната стеатоза, което е в съответствие с констатациите на други 46 .

Въпреки че е общоприето, че хората със затлъстяване имат повишение на плазмените FFAs, важно е да се отбележи, че това не винаги е така, както е прегледано от Karpe и др. 47. В съответствие с предишната ни работа 27,48 и тази на други при мишки 49 и плъхове 41,50,51,52, открихме, че HFD хранените затлъстели мишки са имали постоянно нисък плазмени нива на FFA, отколкото постните контроли за чау. Вероятно обяснение за това е, че животните, хранени с HFD, имат повишена ефективност в усвояването на мастните киселини в тъканите 50. В допълнение, както показахме тук, черният дроб на мишки, хранени с HFD, също показва драстично нарастване на скоростта на синтез на глицеролипиди, което показва, че плазмените FFA и бързо се естеризират и съхраняват, като по този начин намаляват концентрацията им.

Неочаквано откритие беше, че плазмените концентрации на FFA в мишките с обратен хранителен режим са идентични с тези на групата с HFD (т.е. по-ниски от CHOW). Причината за това не става очевидна, докато не се определят чернодробните липидни потоци. Синтезът на глицеролипиди беше значително повишен при HFD мишки в сравнение както с CHOW, така и с групи за обръщане, което обяснява увеличаването на TAG и DAG при тези животни и показва високи нива на естерификация на мастните киселини. Въпреки диверсионните мишки, имащи драматично, но не пълно намаляване на нивата на TAG и DAG на черния дроб, синтезът на глицеролипиди, макар и да не достига статистическа значимост от еднопосочна ANOVA, беше математически увеличен (

В заключение показваме, че мишките с високо съдържание на мазнини и високо захароза, след като бъдат върнати на диета, базирана на чау, доброволно намаляват енергийния си прием, което води до пълно нормализиране на метаболизма на глюкозата в рамките на 7 дни. Интересното е, че това е придружено от частично намаляване на затлъстяването и чернодробните липидни концентрации, което показва, че затлъстяването и липотоксичността сами по себе си не поддържат непременно състоянието на непоносимост към глюкоза и инсулин резистентност при HFD мишки, хранени. По-скоро постоянното прекомерно хранене вероятно ще бъде основният фактор, причиняващ дефекти в метаболизма на глюкозата. Освен това разкриваме, че по време на обръщане на диетата, черният дроб се подлага на сложна метаболитна адаптация, която включва намаляване на DNL в лицето на засилената реестерификация на мастните киселини, механизъм, който вероятно позволява нетна загуба на чернодробни липиди, като същевременно предотвратява прекомерното покачване на Концентрации на FFA поради бързата загуба на затлъстяване.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Ковалски, Г. М. и др. Обратната метаболитна дисрегулация, предизвикана от диета, чрез превключване на диета води до промяна на чернодробната функция de novo липогенеза и синтез на глицеролипиди. Sci. Представител. 6, 27541; doi: 10.1038/srep27541 (2016).