Грегъри Р. Бучан

1 Катедра по фармакология и химическа биология, Университет в Питсбърг, Питсбърг, PA 15261, САЩ

Густаво Боначи

2. CIBICI - CONICET, Departamento de Bioquímica Clínica Facultad de Ciencias Químicas (UNNC) Haya de la Torre y Medina Allende Ciudad Universitaria, Cordoba C.P. №: X5000HUA, Република Аржентина

Марко Фацари

1 Катедра по фармакология и химическа биология, Университет в Питсбърг, Питсбърг, PA 15261, САЩ

3. Fondazione Ri.MED, Via Bandiera 11, 90133 Палермо, Италия

Соня Салваторе

1 Катедра по фармакология и химическа биология, Университет в Питсбърг, Питсбърг, PA 15261, САЩ

Стейси Гелхаус Уендел

1 Катедра по фармакология и химическа биология, Университет в Питсбърг, Питсбърг, PA 15261, САЩ

4. Clinical Translational Science Institute, University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA 15261, USA

Резюме

Нитро-мастните киселини (NO2-FA) са плейотропни модулатори на окислително-редукционни сигнални пътища. Техните ефекти върху възпалителното сигнализиране са проучени много подробно в клетъчни, животински и клинични модели, предимно с използване на екзогенно приложена нитроолеинова киселина. Въпреки че знаем много за тяхната сигнализация, ендогенното образуване на NO2-FA и метаболизмът са сравнително неизследвани. Този преглед ще обхване това, което е известно в момента относно предложените механизми на образуване, диетична модулация на ендогенни нива на NO2-FA и пътища на метаболизъм и откриване на NO2FA и съответните метаболити.

Образуване и метаболизъм на нитро-мастни киселини

Метаболизмът на азотен оксид (• NO) и производството на азотни оксиди при патофизиологични условия генерира нитрозиращи (R-NO) и нитриращи (R-NO2) видове, които реагират с протеини, ненаситени мастни киселини и съдържащи тиол малки молекули като глутатион ( GSH) (1–4). Нитрирането на ненаситени мастни киселини от радикалния азотен диоксид (• NO2) генерира електрофилни, биоактивни липиди, които образуват ковалентни адукти на Михаел с нуклеофилни аминокиселини, предимно цистеин, открити в транскрипционни регулаторни протеини и ензими, участващи в метаболизма, клетъчната сигнализация и редокс хомеостазата (5,6). Доказано е, че пост-транслационната модификация (PTM) от NO2-FA води до дълбоки функционални промени (7,8). Поради това през последното десетилетие нараства интересът към плейотропното сигнализиране на нитромастни киселини (NO2-FA) в многобройни болестни модели, което е довело до значително увеличаване на нашето разбиране за реактивните пътища, които водят до тяхното образуване както и сложността на тяхната адсорбция, метаболизъм и точен анализ (5). Този преглед ще обобщи това, което знаем досега относно образуването in vitro и in vivo и метаболизма на електрофилен NO2-FA.

Нитрация на мастни киселини

киселини

(A) Образуване на NO2-FA от бисалилни ненаситени мастни киселини. (Б) Нитриране на конюгирана линолова киселина. Звездичките показват реактивни електрофилни въглероди.

Ендогенно образуване на нитро мастни киселини в животински модели

NO при реакция на нитриране и нитрозиране.

(A) От NO2 - окисляване до образуване • NO2, последвано от реакция с • NO (B) или директно нуклеофилно заместване.

Тези открития стават релевантни при неутрално рН, където NO2 - не може да генерира HNO2 и образуването на нитриращи и нитрозиращи видове може да е следствие от метална катализа. Нитрирането на cLA е описано в миши модел на остър перитонит, индуциран чрез интраперитонеално инжектиране на LPS и изотопно маркиран 15 N 18 O2 -. В това проучване NO2-cLA се формира от ендогенно генериран 14 • NO2, но прилагането на 15 N 18 O2 - разкрива дозозависимо поколение на 15 N 18 O2-cLA в допълнение към каскада изотополози (15 N 18 O-16 O-cLA, 14 N 18 O- 16 O-cLA и 15 N 16 O- 16 O-cLA), което показва, че генерираният ендогенно • NO реагира с 15 N 18 O2 - за да образува symN2O3 in vivo (23). Този резултат подчертава нова роля за NO2 •/• NO2/• NO система като предшественик на NO2-FA и нитрозиращи междинни продукти, независимо от pH и наличието на метални центрове, чрез образуването на symN2O3 и неговата стохастична хомолиза. По-задълбоченото разбиране на образуването на нитроалкен в животински модели ще помогне в клиничното развитие на NO2-FA, особено в контекста на използването на хранителни добавки на техните прекурсори (т.е. cLA и NO2 -/NO3 -), за да стимулира ендогенното образуване и да предизвика техния сигнален потенциал (3,5).

Образуване на NO2-FA при хората

Нитрат (NO3 -), нитрит (NO2 -) и мастни киселини като олеинова (OA, 18: 1), конюгирана линолова (cLA, 18: 2) и линоленова (cLnA, 18: 3) киселина се намират в хранителни източници, включително зеленчуци, семена и масла, месо и млечни продукти. По-нататъшният метаболизъм на NO3 - и NO2 - води до множество азотни оксиди, включително азотен диоксид (• NO2). Най-податливи на нитриране от NO2 са мастните киселини с конюгирана диенова структура. Поради изобилието си в диетата, cLA е преобладаващата ендогенна мастна киселина, която се нитрира, за да образува NO2-cLA.

Диетата е и основният източник на CLA, където се намира предимно в млечните продукти и месото и първоначално е била призната за метаболитните си ефекти върху затлъстяването, телесния състав, чувствителността към инсулин и свързаността с намален риск от сърдечно-съдови събития (34). cLA е продукт на промотираната от микробиома изомеризация на LA до cLA при хора и животни (35), а червеят също има бактерии с Δ 9-десатуразна активност, способна да метаболизира вацениновата киселина (транс-олеинова киселина) до cLA (36). Преобладаващият хранителен изомер е 9-цис, 11-транс-cLA, докато търговските препарати, направени от слънчогледово масло, съдържат смес от 9-цис, 11-транс и 10-транс, 12-цис-cLA (34). Потвърдено сега от няколко проучвания, cLA е основната ендогенна мастна киселина, която трябва да се нитрира на нива с 5 порядъка по-високи от LA, за да образува NO2-cLA (17). NO2-cLA се образува при основни метаболитни условия при хора и гризачи. Освен това приемът на диети или добавките може да повиши нивата на NO2-cLA най-вероятно поради механизмите на нитриране, описани по-горе (18,37). Нитриране на конюгирана линоленова киселина (cLna, пунинова киселина, 18: 3) също се случва и е основна мастна киселина, открита в нар (

72%); cLna обаче се абсорбира на много по-ниски нива в диетата в сравнение с cLA (38) (Фигура 3).

За да се разбере по-добре как диетата допринася за образуването и сигнализирането на NO2-cLA, пилотно проучване, прилагащо перорално 15 N-маркирани Na ​​15 NO3 - (1 g) и Na 15 NO2 - (20 mg) без (Проба 1) и с cLA (3 g, Проба 2) е проведено при здрави доброволци (18,39). Доброволците бяха рандомизирани или към NO3 - или NO2 - (Проба 1) и след a

В това проучване са изследвани клиничните реакции, за да се изследва въздействието на диетичните липиди върху метаболизма на азотния оксид и сърдечно-съдовите реакции. Диетични добавки от 15 NO3 - и 15 NO2 - поддържат 15 • Образуване на NO, измерено чрез електропарамагнитна резонансна спектроскопия за откриване на 15 NO-дезоксихемоглобинови комплекса. 15 • Образуването на NO води до намалено систолично и средно артериално кръвно налягане и инхибира функцията на тромбоцитите в Проба 1. Едновременното приложение на cLA в Проба 2 намалява нивата на NO3 - и NO2 в плазмата, намалява 15 • Образуване на NO-дезоксихемоглобин, NO2 - инхибиране на тромбоцитно активиране и съдоразширяващите свойства на NO2 - като същевременно засилват образуването на 15 NO2-cLA. По този начин едновременното приложение на хранителната добавка, cLA, значително пренасочва сърдечните реакции, приписани на NO2 -/• NO към алтернативни пътища (39).

Откриването на ендогенно образуване на NO2-cLA при хора при базални условия и повишеното му образуване и сигнализиране по време на възпаление и метаболитен стрес разширява фармакокинетиката и обхвата на • NO сигнализиране извън производството на cGMP, зависим от гуанилат циклаза. Въпреки че механизмите на образуване и сигнализиране на NO2-cLA са изследвани in vitro и в животински модели и до известна степен сега при хората, все още има много неща, които не знаем. По-нататъшни проучвания са оправдани, за да се изследва как диетата, добавките на прекурсори и микробиома влияят върху образуването и сигнализирането на NO2-cLA в сравнение с приложението на предварително образувания NO2-FA като химични и пътни цели на NO3 -/NO2 - + cLA и NO2 -cLA ще варира значително.

Метаболизъм и разпределение на NO2-FA

Образуването, метаболизмът, разпределението и екскрецията на NO2-FA включват метаболитна мрежа, способна да регулира нивата на стационарно състояние и сигналната активност на тези молекули както при базални, така и при патологични състояния (Фигура 4). Откриването и измерването на NO2-FA и метаболитите по своята същност е предизвикателство, тъй като те образуват обратими ковалентни адукти с нуклеофилни аминокиселини в протеини и цистеини в тиол съдържащи молекули, като GSH. Освен това като видове мастни киселини, те свързват джобовете за свързване на мастни киселини с протеини-носители като албумин (40) и участват в нормалния липиден метаболизъм и транспорт, когато преминават през насищане, β-окисление и се естерифицират в сложни липиди (41–44). Ще бъдат необходими пълни познания за техния метаболизъм, за да се разбере напълно тяхната роля като нови терапевтични средства за различни възпалителни заболявания и последните проучвания започват да разкриват техния фармакокинетичен профил.

NO2-FA образуват обратими ковалентни адукти с реактивни тиоли и могат също да бъдат включени в сложни липиди. Свободни видове NO2-FA и метаболити се откриват в плазмата, тъканите и урината. NO2-FA се редуцират до неелектрофилни нитроалкани чрез простагландин редуктаза и както нитроалканите, така и алкените претърпяват β-окисление. В урината са открити дикарбоксилни киселини, получени от ω окисление, както и конюгати, получени от таурин и GSH.

Подобно на други мастни киселини, продуктите за насищане и β-окисление, както и конюгатите на NO2-FA-коензим А (NO2-FA-CoA) са открити и добре характеризирани от LC-MS/MS (44). Много PK проучвания използват NO2-OA като модел NO2-FA, тъй като той има една двойна връзка, което прави метаболизма по-лесен за характеризиране; въпреки че все повече доказателства предполагат, че метаболизмът на NO2-cLA следва много подобен модел. Преобладаващите видове свободни мастни киселини в резултат на метаболизма на NO2-OA е нитростеариновата киселина (NO2-SA) (44). NO2-SA е неелектрофилен нитроалкан, образуван от насищането на електрофилната двойна връзка на NO2-OA от простагландин редуктаза 1 (PTGR1) (45). NO2-OA и NO2-SA могат да претърпят няколко кръга на β-окисление, за да образуват динор (С16), тетранор (С14) и хексанор (С12). Подобни метаболити са описани за NO2-cLA и тези видове са открити в животински модели и човешка плазма и урина при базални условия и след добавяне (37). Други окислени и нитрирани продукти (напр. Нитро-нитрати, хидроксил-NO2-FA) са наблюдавани в различни проучвания, но не са изследвани подробно (46–48) (Фигура 4).

Неотдавнашно проучване даде още по-подробен доклад за метаболизма на NO2-FA и откри таурин и сулфо-адукти заедно с ω-окислителните продукти, както се вижда от дикарбоксилни метаболити на редуциран и електрофилен NO2-FA (49). Много от тези продукти се намират както при гризачи, така и при хора. NO2-FA лесно образуват адукти с GSH и тези адукти се изнасят от клетките чрез мултилекарствени резистентни транспортери (50,51) и метаболити на адукция на GSH се откриват в урината като NO2-FA адукти на N-ацетилцистеин и цистеин (37,49 ). Тези продукти са в равновесие със свободен NO2-FA и съответните метаболити в урината и могат лесно да бъдат изместени чрез тиолова реакция с живачен хлорид, увеличавайки свободния пул на NO2-FA с порядък (37) (Фигура 4).

Тънкостите на метаболизма и разпределението на NO2-FA бавно се разплитат, тъй като се съобщава за включването на NO2-FA в сложни липиди в клетките и in vivo (Фигура 4). Образуването на NO2-FA-съдържащи триглицериди (TG) са анализирани по време на in vitro киселинното стомашно разграждане на TG и в адипоцитите и плазмата на плъхове след добавяне на NO2-OA (41), докато ендогенно образувани NO2-FA и нитрооксидирани фосфолипиди са били открити в изолирани сърдечни митохондрии и кардиомиобласти при животински модел тип 1 на захарен диабет (48). Тези данни показват, че NO2-FA-съдържащите сложни липиди могат да се генерират след стомашно храносмилане и възпалителни състояния.

18 × по-голямо в MG + DG срещу TG. Профилът за NO2-cLA е подобен на NO2-OA; общата естерификация обаче е с 10-20% по-ниска. Като цяло има по-ниски нива на включване във фосфолипиди в сравнение с глицеролипидите (41). Тези данни показват, че NO2-FA и метаболитите се разпределят и включват в сложни липиди, които могат да освободят електрофилни видове след липазна хидролиза и да бъдат доставени в отдалечената тъкан като липопротеини, като по този начин модулират клетъчната хомеостаза и тъканната сигнализация.

Заключения и бъдещи изследвания

Механизмите на нитриране на мастни киселини in vivo остават неясни; през последните години обаче бяха постигнати важни постижения за изясняване на молекулните посредници, участващи в нитрирането, неговите молекулни цели и получените продукти от реакцията. Потвърждаването на cLA като първичен ендогенен NO2-FA, правилното измерване на свободния ендогенен NO2-OA, както и новите анализи на включването на NO2-FA в сложни липиди помогнаха да се оформи цялостната картина на образуването на NO2-FA и осигури по-добра представа за фармакокинетика и фармакодинамика на тези плейотропни противовъзпалителни терапии. Анализът на екскретираната радиоактивност и метаболити в урината показва, че 10-NO2-OA се абсорбира екстензивно и бързо се метаболизира в рамките на 24 часа (49). Необходими са бъдещи проучвания, фокусирани върху чревната абсорбция на NO2-FA и оценката на метаболизма в черния дроб (първо преминаване), тъй като те трябва да разрешат несъответствието между първоначалните доклади за бионаличността на NO2-OA (

6%) (непубликувани данни) и 35% възстановяване на урината, отчетени в проучване [14 C] -NO2-OA плъхове (49). Възможно е значителна част от NO2-FA да се съхранява в сложни липиди и да се разпределя в различни тъкани. Тези проучвания, заедно с по-нататъшното характеризиране на новите метаболити на NO2-FA и изследването на следващото поколение производни на NO2-FA (54) като терапевтични средства, ще продължат да разширяват познанията ни за образуването и метаболизма на този плейотропен клас от терапевтични сигнални молекули.

Акценти

Образуването на азотно-мастна киселина (NO2-FA) е силно зависимо от факторите на околната среда, включително pH, напрежението на кислорода и наличието на реактивни видове.

NO2-cLA е най-разпространеният, ендогенен NO2-FA.

NO2-cLA се генерира по време на метаболизма и в условията на възпалителен стрес.

Абсолютното измерване на NO2-FA се усложнява от аддукция на протеини, метаболизъм (редукция, β-окисление, конюгация) и включване в сложни липиди.

Благодарности.

Тази работа беше подкрепена от финансиране от следните източници: R21AI122071 (SGW), F31HL142171 (GJB), Fondazione Ri.Med, Италия (MAF) и Fondo para la Investigación Cientifica y Tecnológica (FONCyT) и Prestamo BID Proyetcto de Investigación en Cienceia Безвъзмездна помощ за Tecnologia (PICT) 2013-3288 (GB).

Бележки под линия

Отказ от отговорност на издателя: Това е PDF файл на нередактиран ръкопис, който е приет за публикуване. Като услуга за нашите клиенти ние предоставяме тази ранна версия на ръкописа. Ръкописът ще бъде подложен на копиране, набиране и преглед на полученото доказателство, преди да бъде публикуван в окончателния си вид. Моля, обърнете внимание, че по време на производствения процес могат да бъдат открити грешки, които биха могли да повлияят на съдържанието, и всички правни откази от отговорност, които се отнасят до списанието, се отнасят до.

Декларация за интереси. SGW признава финансов интерес към Complexa, Inc.