Мириам Е. Мособа

Център за безопасност на храните и приложно хранене (CFSAN), Служба за приложни изследвания и оценка на безопасността (OARSA), Отдел по токсикология (DOT), Американска администрация по храните и лекарствата (US FDA), Невротоксикологичен и ин витро токсикологичен клон (NIVTB), 8301 Muirkirk Road, Laurel, MD 20708, САЩ

Томас Дж. Флин

Център за безопасност на храните и приложно хранене (CFSAN), Служба за приложни изследвания и оценка на безопасността (OARSA), Отдел по токсикология (DOT), Американска администрация по храните и лекарствата (US FDA), Невротоксикологичен и ин витро токсикологичен клон (NIVTB), 8301 Muirkirk Road, Laurel, MD 20708, САЩ

Санах Вохра

Център за безопасност на храните и приложно хранене (CFSAN), Служба за приложни изследвания и оценка на безопасността (OARSA), Отдел по токсикология (DOT), Американска администрация по храните и лекарствата (US FDA), Невротоксикологичен и ин витро токсикологичен клон (NIVTB), 8301 Muirkirk Road, Laurel, MD 20708, САЩ

Пади Визенфелд

Център за безопасност на храните и приложно хранене (CFSAN), Служба за приложни изследвания и оценка на безопасността (OARSA), Отдел по токсикология (DOT), Американска администрация по храните и лекарствата (US FDA), Невротоксикологичен и ин витро токсикологичен клон (NIVTB), 8301 Muirkirk Road, Laurel, MD 20708, САЩ

Робърт Л. Спрандо

Център за безопасност на храните и приложно хранене (CFSAN), Служба за приложни изследвания и оценка на безопасността (OARSA), Отдел по токсикология (DOT), Американска администрация по храните и лекарствата (US FDA), Невротоксикологичен и ин витро токсикологичен клон (NIVTB), 8301 Muirkirk Road, Laurel, MD 20708, САЩ

Резюме

Неотдавнашното нарастване на употребата на хранителни добавки, включително билкови лекарства, налага разследване на техните профили на безопасност. „Билка мечта“, Calea zacatechichi, отдавна се използва в традиционната народна медицина за различни цели и в момента се предлага на пазара в САЩ за медицински цели, включително лечение на диабет. Въпреки присъщата уязвимост на бъбречната система към ксенобиотична токсичност, липсват проучвания за безопасност относно нефротоксичния потенциал на тази билка. Освен това, високата честота на свързаните с диабет бъбречни заболявания прави скрининга за безопасност на C. zacatechichi за безопасност особено важен. Изложихме човешки проксимални тубулни HK-2 клетки на нарастващи дози от тази билка, заедно с известни контролни съединения за токсиканти и протектори, за да изследваме потенциалните токсични ефекти на C. zacatechichi спрямо контролните съединения. Оценихме както клетъчните, така и митохондриалните функционални промени, свързани с токсичността на тази хранителна добавка, и установихме, че дори при ниски дози доказателствата за клетъчна токсичност са значителни. Освен това тези констатации корелират със значително повишени нива на биомаркери за нефротоксичност, осигурявайки допълнителна подкрепа за необходимостта от допълнителен контрол върху безопасността на тази билкова хранителна добавка.

1. Въведение

Calea zacatechichi (наричана още Calea ternifolia или „Dream Herb”) е цъфтящо растение, родено в Централна Америка и има дълга традиция да се използва като лечебно растение в местни култури [1]. Излагането чрез вдишване (пушене) или поглъщане (като чай) се използва предимно за временно засилване на осъзнатото сънуване. Също така се използва широко за лечение на проблеми, свързани със стомашно-чревната и ендокринната системи [2]. Наскоро се предлага на пазара като хранителна добавка при лечението на диабет поради способността му да индуцира хипогликемични ефекти [3–5], въпреки че неговият (ите) механизъм (и) на действие остават неясни.

Онейрогенните и други биологични ефекти на C. zacatechichi се дължат отчасти на техните флавони и гермакролидни компоненти [6–10]. Въпреки това, флавоните представляват клас флавоноиди, за които е доказано, че носят цитотоксични ефекти отчасти чрез индукция на ензимната експресия на цитохром Р450 [11–13]. Освен това гермакролидите са част от класа на сесквитерпеновите лактони, които също могат да проявяват отрицателни ефекти както върху прокариотните, така и върху клетките на бозайници [14]. Цитотоксичността както на флавоноидите, така и на сесквитерпеновите лактони е използвана за използване като терапия срещу рак [15, 16].

2. Материали и методи

2.1. Характеризиране на екстракт от Calea zacatechichi

Проби от ваучери на C. zacatechichi, депозирани в Университета на Мисисипи, Национален център за изследване на природни продукти (NCNPR) (NCNPR # 2443), бяха удостоверени с помощта на макроскопия и методи на микроскопия от ботаник на NCNPR. Метанолов екстракт от C. zacatechichi се осигурява в лиофилизирана форма от NCNPR и се съхранява на тъмно при 4 ° С във вакуумна камера. Изсушеният екстракт от C. zacatechichi се анализира чрез LC/QTof, както е описано по-горе [29]. Съединенията са предполагаемо идентифицирани чрез съвпадение на точната маса на аналитите с компонентите на C. zacatechichi, съобщени в литературата [8, 30–33].

2.2. Клетъчна култура и лечения

Клетките HK-2 се отглеждат, поддържат и обработват по начин, подобен на описания по-горе [29]. Изработени са разтвори за обработка на запасите от C. zacatechichi, нефротоксикант (положителен контрол) цис-диаминплатина (II) дихлорид (цисплатин) (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО) и нефропротектор (отрицателен контрол) валпроева киселина (Sigma-Aldrich) чрез претегляне на техните прахове, разтварянето им в DMSO и разреждането на тази смес със среда за краен разтвор на DMSO от 0,4% или по-малко. Клетките се инкубират през нощта и се третират в три екземпляра в продължение на 24 часа в дозовия диапазон 0–1000 μg/mL.

2.3. Анализ на цитотоксичността

Цитотоксичността, свързана с лечението, се определя, като се използва установеният тест за жизнеспособност на CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI), следвайки препоръките на производителя. Предпоставката на този луминесцентен анализ е, че производството на АТФ е право пропорционално на жизнеспособността на клетките, тъй като АТФ е от основно значение за енергията, необходима за жизненоважни клетъчни процеси. Обработените клетки в плаки с прозрачни дъна с 96 ямки се уравновесяват до стайна температура в продължение на 30 минути, като през това време водата във външните ямки се заменя с приблизително 100 uL обработка или контроли само за среда. След това към всяка ямка беше добавен равен обем от работния разтвор на CellTiter-Glo. Плаките се поставят върху орбитален шейкър за 2 минути, за да се индуцира клетъчен лизис и след това се инкубират още 10 минути, преди да се прочетат на четец на плочи OMG Fluorostar (BMG LABTECH, Ортенберг, Германия), за да се измери нивото на луминесценция, излъчвана от всяка ямка.

2.4. Анализ на реактивни кислородни видове

Количественото определяне на реактивните кислородни видове (ROS) беше определено, използвайки системата за откриване, базирана на луминесценция на Promega, и данните бяха нормализирани към жизнеспособността на клетките. След 24 часа директно излагане на C. zacatechichi, клетките бяха инкубирани с H2O2 субстрат и реагент за откриване, както се препоръчва в инструкциите на производителя. Луминесценцията беше отчетена на четец за плочи OMG Fluorostar.

2.5. Анализ на потенциала на митохондриалната мембрана

Промените в потенциала на митохондриалната мембрана (MMP) бяха оценени с помощта на съотношението на оцветителя JC-10 (Enzo, Farmingdale, NY). Клетките HK-2, които бяха директно изложени на C. zacatechichi, се оцветяват с 20 uM JC-10 (крайна концентрация) в продължение на 2 часа, измиват се и след това се отчитат с четец на плаки (OMG Fluorostar). Възбуждането е настроено на 485 nm и е измерено емисиите на 520 и 590 nm. Също така проверихме, че екстрактът или носителят сами по себе си не произвеждат значителни сигнали за емисии.

2.6. Анализи за нефротоксичност на биомаркери

Културните супернатанти от клетки, третирани в продължение на 24 часа с C. zacatechichi, цисплатин и валпроева киселина в дози от 333 и 111 μg/ml, бяха оценени за нива на биомаркери на бъбречна токсичност: бъбречно нараняване-1 (KIM-1), албумин, цистатин С и бета-2-микроглобулин (B2M), използвайки комплекти за токсичност за човешки бъбреци (Bio-Rad, Hercules, CA). Следвайки протокола на производителя, плочките бяха блокирани, измити и инкубирани с проби, стандартни разтвори за откриване на антитела, преди да им се даде окончателно измиване. Плаките бяха разчетени с помощта на инструмент Luminex 200 (Bio-Rad). Нивата на експресия на биомаркери се нормализират до жизнеспособност на клетките.

2.7. Статистика

Microsoft Excel и Prism (GraphPad, Сан Диего, Калифорния) бяха използвани за изчисления и анализи на всички събрани данни. Използвани са t-тестове на Student или двупосочни ANOVA, за да се определи дали дозовите ефекти на лечението са статистически значими при стойности на P по-ниски от 0,01 или 0,001, както е посочено.

3. Резултати

3.1. Характеризиране на екстракт от Calea zacatechichi

LC с висока разделителна способност установи общо 231 молекулни характеристики в екстракта от C. zacatechichi. От тях 24 характеристики имат точна маса, съответстваща на съобщаваните компоненти на C. zacatechichi (Фигура 1). Основните компоненти, базирани на пиковия обем, калеин А, цилиарин, акацетин и калеалактон С, представляват около 50% от известните съединения и 8% от общите съединения [8, 30–33].

calea

Екстрахира се обща хроматограма на съединението от химическа характеристика на екстракта C. zacatechichi чрез LC масова спектроскопия с висока разделителна способност. Идентификацията на Putative съединение е направена чрез съвпадение на точната маса с тази на известните компоненти на C. zacatechichi [8, 30–33]. (1) Ciliarin, (2) zexbrevin, (3) sesquiterpene lactone, (4) calein D, (5) 1-β-ацетоксизакатехинолид, (6) calein A, (7) 1-oxo-zacatechinolide, (8) calealactone Е, (9) калеалактон и (10) ацетоксикалекулатолид.

3.2. C. zacatechichi силно инхибира HK-2 жизнеспособността на клетките

За да се изследва нефротоксичността на C. zacatechichi, ние извършихме анализ на жизнеспособността на клетки, базиран на АТР, върху HK-2 клетки, третирани с 6-дозов концентрационен диапазон от 0 до 1000 μg/ml за 24 часа. За сравнение, ние също третирахме клетки в продължение на 24 часа с дозово съвпадащи концентрации на известното нефротоксично съединение, цисплатин и известния нефропротектор, валпроева киселина. Открихме, че цисплатин индуцира значително намаляване на жизнеспособността на клетките, започвайки от

Тествана доза от 12 μg/ml (P Фигура 2). По същия начин се открива значителна цитотоксичност на C. zacatechichi, започвайки от 37,0 μg/mL (P Фигура 2. Както се очаква от нефропротектор, изчислената LC50 стойност на валпроевата киселина е доста висока при 3866 μg/mL, като се има предвид формата на платото на нейната клетка крива на жизнеспособност.