Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Изследване на затлъстяването, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Изследване на затлъстяването, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Дискавъри Информатика, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Информатика по Дискавъри, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Информатика по Дискавъри, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Изследване на затлъстяването, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Изследване на затлъстяването, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Изследване на затлъстяването, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Информатика по Дискавъри, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Интегративна биология, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Дискавъри Информатика, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Дискавъри Информатика, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Изследване на затлъстяването, Lilly Research Laboratories, Eli Lilly and Company, Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, USA

Резюме

Обективен: Приложихме сравнителен функционален геномичен подход, за да оценим дали индуцираните от диета плъхове със затлъстяване (DIO) служат като ефективен модел на затлъстяване.

Методи и процедури: Профилите за генна експресия на епидидимална мазнина от DIO и постни плъхове бяха генерирани с помощта на микрочипове и сравнени с публикуваните масиви от данни за затлъстели и не-затлъстели човешки подкожни адипоцити.

Резултати: Калоричният прием и горивната ефективност са значително по-високи при плъховете DIO, което води до повишено телесно тегло и затлъстяване. Циркулиращите нива на глюкоза, холестерол, триглицериди, инсулин и лептин при DIO плъхове са значително по-високи от тези в постните контроли. DIO плъховете също показват нарушена инсулинова чувствителност. Директното сравнение на профилите на генна експресия от DIO и слаби плъхове и тези от затлъстели и не-затлъстели хора разкри, че глобалните модели на генна експресия в DIO плъхови мазнини приличат на тези при затлъстели човешки адипоцити. Диференциално експресираните гени между затлъстели и не-затлъстели субекти в проучвания както при хора, така и при плъхове бяха идентифицирани и свързани с биологични пътища чрез картографиране на гените в категориите за генна онтология (GO). Гените, свързани с имунния отговор и гените, свързани с ангиогенезата, показват значително регулиране както при затлъстели хора, така и при плъхове DIO в сравнение с контролите, които не са със затлъстяване. Въпреки това, гените в метаболизма на мастните киселини и окисляването показват широко регулиране само при затлъстели човешки адипоцити, но не и при DIO плъши епидидимална мазнина.

Дискусия: Нашето проучване, базирано на профилиране на генна експресия, предполага, че плъховете DIO като цяло представляват подходящ модел на затлъстяване. Въпреки това, несъответствията в промените в генната експресия между плъхове DIO и затлъстели хора, особено в метаболитните пътища, могат да обяснят ограниченията при използването на модели на DIO гризачи при изследване на затлъстяването и откриване на лекарства.

Въведение

Добре е известно, че затлъстяването е свързано с висок риск от инсулинова резистентност, което води до метаболитни заболявания като диабет тип 2, както и сърдечно-съдови заболявания ((10), (11)). Мастните тъкани играят критична роля не само в етиологията на затлъстяването, но и в неговите патофизиологични последици ((12)). В това проучване докладваме за изследване на промените в генната експресия в епидидималната мазнина на плъхове DIO и директно сравнение на данните за профилиране на генната експресия, които сме генерирали с докладвани по-рано профили на генна експресия на мастна тъкан, взети от затлъстели и не затлъстели индианци Pima ((13)), популация с високо разпространение на затлъстяване и диабет тип 2. Целта на това проучване е да се оцени DIO плъховете като модел на затлъстяване, базиран на профили на генна експресия. Освен това, данните за профилиране на глобалната генна експресия могат да хвърлят светлина върху генната регулация в развитието на болестта и да помогнат за идентифицирането на нови гени за чувствителност към затлъстяване.

Методи и процедури

Животни

Частна колония от мъжки плъхове Long-Evans е създадена в Harlan (Harlan-Sprague Dawley, Indianapolis, IN). Животните са били на диета с високо съдържание на мазнини и захароза (TD95217, Harlan Takled, Madison, WI) или с обикновена чау (Purina 5008; Ralston-Purina, Сейнт Луис, Мисури) от отбиването. Плъховете бяха изпратени на 14-седмична възраст до нашето съоръжение и се поддържаха на 12: 12-часов светло-тъмен фотопериод (светлина в 22:00 ч.). По време на проучването те бяха настанени индивидуално при температура на околната среда и имаха свободен достъп до диетата и водата. След 2 седмици аклиматизация в съоръжението, телесното тегло на плъховете и теглото на консумираната храна през предходните 7 дни се измерват веднъж седмично. Масата на телесните мазнини се анализира чрез ядрено-магнитен резонанс, като се използва инструмент Echo Medical System (Houston, TX) три пъти по време на проучването. Безмаслена маса е разликата между телесната маса и мастната маса. Всички проучвания върху животни са проведени в съответствие с одобрените институционални протоколи за грижа и употреба на животните в съответствие с насоките на Националните здравни институти (публикация на NIH № 86-23, 1985).

Тест за орален глюкозен толеранс

Тестът за орален глюкозен толеранс се провежда след гладуване през нощта, когато животните са на възраст 21 седмици. След изходно вземане на кръв (време 0), животните се дозират перорално с 1,5 g/kg глюкоза. Последващи кръвни проби се събират на 30, 60 и 120 минути след глюкозното предизвикателство за определяне на плазмените нива на глюкоза и инсулин.

Циркулиращи показатели на метаболизма

На 25-седмична възраст кръвта се събира чрез кръвотечение от опашката след еднодневно гладуване. Плъхове бяха убити една седмица по-късно в 09:00 ч. Чрез бързо обезглавяване. Събира се кръв от багажника и се изрязва епидидималната мастна тъкан. Различни метаболитни параметри на циркулирането бяха измерени при гладуване (седмица 25) и хранене (седмица 26).

Микрочип

Общата РНК от епидидимална мазнина на плъх е изолирана с RNA STAT-60 (Тест-тест) съгласно протокола на производителя. Пет микрограма обща РНК бяха маркирани и хибридизирани с масиви Affymetrix RAE230_2 съгласно протокола Affymetrix. Всяка проба се хибридизира до един микрочип. Всички проби бяха оценени за качество на РНК, като коефициенти на мащабиране на микрочипове, фонови нива, проценти настоящи повиквания, съотношения на β-актин и глицералдехид 3-фосфат дехидрогеназа 3 ′/5 ′. Проби с съотношения 3 '/ 5' над праг 3 бяха изключени от по-нататъшен анализ. Суровите данни за генната експресия са депозирани в NCBI Gene Expression Omnibus (http: www.ncbi.nlm.nih.govgeoqueryacc.cgiaccGSE8700).

Статистически анализ на метаболитни данни

Всички стойности са изразени като средно ± s.e.m. Статистическите анализи бяха извършени от еднопосочен ANOVA, последван от Tukey т-тест.

Анализи на данни от микрочипове

Интегративен йерархичен анализ на клъстерирането беше извършен с помощта на корелацията на Пиърсън като метрика на разстоянието и средно групиране на връзки в софтуера Spotfire Decision Suite. Класификацията беше извършена с помощта на дискриминантната функция на Fisher и алгоритъма на машината за подпомагане на вектор, които бяха приложени в статистическия език R. Преди йерархичното групиране и анализ на класификацията данните от масива бяха стандартизирани до средна стойност 0 и s.d. от 1 за всяка сонда във всички проби. Стандартизацията на данните се извършва отделно за наборите от данни за хора и плъхове. Анализът за обогатяване на генни набори (GSEA) беше извършен с помощта на софтуера Gsea ((16)). Като праг за определяне на статистическа значимост е използван процент на фалшиво откриване от 0,1.

Експресия на ген чрез TaqMan в реално време PCR

Резултати

Телесно тегло и консумация на храна

На възраст от 3 седмици мъжките плъхове Long-Evans бяха назначени на диета с високо съдържание на мазнини (DIO плъхове) или стандартна чау с ниско съдържание на мазнини (постни плъхове) до 26-седмична възраст. Животните с най-значимо наддаване на тегло в групата DIO са избрани, за да увеличат максимално разликите между двете групи. На 16 седмична възраст слабите плъхове тежат 443,2 ± 5,0 g, а DIO плъховете тежат 588,1 ± 4,9 g (P

индуцирани

: (а) Телесно тегло, (б) калориен прием и (° С) горивна ефективност при слаби и индуцирани от диета плъхове със затлъстяване (DIO). Стойностите се изразяват като средна стойност ± s.e.m. Телесното тегло е значително различно във всички времеви моменти (P

Състав на тялото

Анализите на състава на цялото тяло показват, че плъховете DIO имат приблизително два пъти телесната мастна маса от тези в слабата група (P

: (а) Маслена маса, (б) процент мазнини, (° С) маса без мазнини и (д) процента маса без мазнини при слаби и индуцирани от диета плъхове със затлъстяване (DIO). Стойностите се изразяват като средна стойност ± s.e.m. Стойностите на съответния параметър се различават значително във всички времеви точки (P

Метаболитни показатели и инсулинова чувствителност

Плазмената глюкоза на гладно, общия холестерол, триглицеридите, инсулина и лептина са значително повишени при DIO плъховете в сравнение с тези на слабите животни на 25-седмична възраст. При хранените животни нивата на общия холестерол, триглицеридите, инсулина и лептина са значително по-високи при плъховете DIO (P (13)).

Групи Глюкоза (mg/dl) Chol (mg/dl) Trig (mg/dl) Инсулин (ng/dl) Лептин (ng/ml) Глюка (pg/ml) Adip (μg/ml) FFA (μEq/l) GH (ng/ml)
На гладно
Постно 134,6 ± 4,1 76,2 ± 2,4 112,6 ± 6,1 0,6 ± 0,2 5,0 ± 0,5 52,4 ± 3,5 3,3 ± 0,2 860,2 ± 49,4 2,8 ± 0,9
DIO 162,9 ± 3,6 102,9 ± 3,7 * 223,0 ± 29,5 * 3,3 ± 0,3 * 19,2 ± 1,5 * 50,4 ± 4,2 4,7 ± 0,3 * 821,8 ± 38,4 3,4 ± 0,9
Фед
Постно 156,9 ± 3,6 75,4 ± 2,0 263,3 ± 25,2 2,9 ± 0,3 10,9 ± 1,9 81,6 ± 8,2 1,7 ± 0,2 257,2 ± 12,2 3,2 ± 1,8
DIO 153,4 ± 3,5 103,8 ± 1,8 * 470,5 ± 61,2 * 4,2 ± 0,6 * 29,4 ± 1,2 * 81,4 ± 5,6 3,0 ± 0,3 * 510,0 ± 29,2 * 6,0 ± 3,1
  • Адип, адипонектин; Хол, холестерол; FFA, свободна мастна киселина; GH, хормон на растежа; Глюка, глюкагон; Триг, триглицерид.
  • * P

: (а) Глюкоза в плазмата и (б) инсулин по време на орален тест за глюкозен толеранс при слаби и индуцирани от диета плъхове със затлъстяване (DIO). Стойностите се изразяват като средна стойност ± s.e.m. Нивата на глюкоза и инсулин се различават значително по всяко време (P

Анализи на профилиране на генно експресиране на DIO плъхове и човешко затлъстяване

: Интегративен клъстер анализ. (а) Йерархично групиране на 39 човешки проби и 15 проби от плъхове. Данните са представени във формат на матрица, където колоните представляват отделни проби, а редовете представляват изпитания на масивите. Червеният и зеленият цвят показват съответно високи и ниски изрази. Данните бяха стандартизирани до средна стойност 0 и s.d. от 1, както е описано в Методи и процедури. (б) Колонна дендрограма на клъстерния анализ. Общо 54 проби бяха разделени в два основни клъстера. Идентичността на всяка проба е етикетирана и цветно кодирана. DIO, затлъстяване, предизвикано от диета.

Въпреки че припокриването на диференциално експресирани гени при затлъстели в сравнение с не-затлъстелите сравнения между наборите от данни за хора и плъхове е минимално, има съществено припокриване между GO категориите, към които са картографирани диференциално експресираните гени. Свързаните с имунен отговор GO термини са свръхпредставени в надрегулирани гени както при плъхове DIO, така и при затлъстели хора (Таблица 2). Въпреки това, GO биологичните процеси, участващи в ангиогенезата и морфогенезата, са били свръхпредставени в надрегулирани гени само при затлъстяване при хора, но не и при плъхове DIO (Таблица 2). Освен това категориите GO, свързани с липидния метаболизъм, като метаболизма на мастните киселини и окисляването, са свръхпредставени само в гени, които са били регулирани надолу в затлъстелите човешки адипоцити (Таблица 3).

Намаляване на регулацията при затлъстели плъхове, предизвикано от диета
Нито един Свързани с метаболизма
Метаболизъм на органична киселина
Метаболизъм на мастните киселини
Метаболизъм на карбоксилната киселина
Липиден метаболизъм
Окисляване на мастни киселини

: Експресия на гени, свързани с ангиогенезата, в индуцирано от диета затлъстяване (DIO) и слаби мастни тъкани на плъхове. Средната експресия на всички гени (сиво) и свързаните с ангиогенезата гени (червено) е начертана за DIO плъхове спрямо слаби плъхове. Всяка точка представлява един ген. х- Ос и уОсите представляват средни стойности на експресия на всеки ген съответно в слабата и DIO групата. Гените по диагоналната линия се изразяват на същото ниво в DIO и постните групи.

Валидиране на данни за генна експресия на микрочипове чрез обратна транскрипция-PCR

: Валидиране на данните за генната експресия на микрочипове чрез PCR анализ в реално време. Нивата на генна експресия са представени като съотношението на целевия ген към 60S киселинен рибозомен фосфопротеин (ARBP). Нивото на експресия на целевия ген при слаби плъхове произволно е получило стойността на 1. Статистическа значимост (P

Дискусия

Докато нашето проучване се фокусира върху генната експресия при DIO плъхове, ние прегледахме литература за профилиране на експресия на микрочипове на мастни клетки от DIO мишки. Повишена експресия на възпалителни гени се съобщава в множество публикации ((4), (5), (22)), в съответствие с това, което се наблюдава при плъхове DIO и затлъстели хора. Въпреки че гените за липиден метаболизъм като лептин и липопротеинова липаза показват повишена експресия при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини ((8)), друго проучване показва, че транскрипционните фактори, свързани с адипозността и адипогенните маркери, показват малка промяна в експресията ((6) ). Към данните за микрочиповете обаче бяха приложени различни методи за анализ и критерии за статистическо филтриране. Освен това животните са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини за различни периоди от време. Следователно е трудно да се стигне до някакви категорични заключения при сравняване на нашите данни за DIO плъхове с докладваните проучвания на DIO мишки. Понастоящем планираме да проведем експеримент с микрочипове върху DIO мишки, жирови, следвайки същия експериментален дизайн, и да приложим систематичен сравнителен функционален геномен анализ за оценка на приликите на генно-експресионните промени при DIO плъхове, DIO мишки и затлъстели хора.

В обобщение установихме молекулярна връзка между модела на DIO плъхове и човешкото затлъстяване. Нашето проучване не само предполага, че плъховете DIO до голяма степен представляват подходящ модел на затлъстяване, но също така дава насоки за бъдещи усилия за оценка на експериментални модели на системи, използвайки сравнителния функционален геномичен подход.

ДОПЪЛНИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

Допълнителните материали са свързани с онлайн версията на статията на http: www.nature.comoby.

ОПОВЕСТЯВАНЕ

Авторите не декларират конфликт на интереси.