Поискахте машинен превод на избрано съдържание от нашите бази данни. Тази функционалност е предоставена единствено за ваше улеснение и по никакъв начин не е предназначена да замени човешкия превод. Нито SPIE, нито собствениците и издателите на съдържанието правят и те изрично се отказват от каквито и да било изрични или подразбиращи се декларации или гаранции от всякакъв вид, включително, без ограничение, изявления и гаранции по отношение на функционалността на функцията за превод или точността или пълнотата на преводите.

еластин

Преводите не се запазват в нашата система. Използването от ваша страна на тази функция и преводите е предмет на всички ограничения за използване, съдържащи се в Общите условия за ползване на уебсайта на SPIE.

18 декември 2019 г.

Оценка на състоянието на колаген и еластин при лимфедем, използвайки мултифотонна микроскопия

Виктор В. Николаев, 1,2 Екатерина А. Сандикова, 2,3 Оксана С. Курочкина, 4 Денис А. Връжнов, 1,2 Наталия А. Кривова, 2 Юрий В. Кистенев, 2,4 Елена С. Сим 2, 3

1 Институт по физика на якостта и материалознание (Руска федерация)
2 Национален изследователски Томски държавен университет. (Руска федерация)
3 Сибирски държавен медицински университет (Руска федерация)
4 Институт по микрохирургия (Руска федерация)

СПЕСТЕТЕ В МОЯТА БИБЛИОТЕКА

ЗАКУПЕТЕ ТОВА СЪДЪРЖАНИЕ

АБОНИРАЙТЕ СЕ ЗА ДИГИТАЛНА БИБЛИОТЕКА

50 изтегляния на 1-годишен абонамент

25 изтегляния на едногодишен абонамент

ЗАКУПЕТЕ ЕДИНЕН СТАТИЙ

Включва PDF, HTML и видео, когато са налични

Методите на двуфотонната микроскопия се използват широко при изследването на биологични обекти, по-специално на кожата, поради възможността да се изследват обекти както на повърхността, така и на дълбочина, без да се привличат допълнителни флуорофори поради ендогенна автофлуоресценция. В тази статия се прилагат методите за анализ на изображението на AF сигнала и SHG сигнала за оценка на състоянието на кожата по време на развитието на лимфедем. Показано е, че за групи здрави тъкани и лимфедематозни, използващи хистограми на SAAID разпределение, могат да бъдат открити промени в тъканите.

ВЪВЕДЕНИЕ

Лимфедемът е хронично, прогресиращо заболяване на лимфната система, което е свързано с недостатъчна циркулация на лимфата и последващо натрупване на високобелтъчна интерстициална течност, което води до възпаление, хипертрофия на мастната тъкан и разпространение на фиброза с необратими структурни увреждания. 1 На практика изглежда като подуване на засегнатите тъкани. Лимфедемът засяга лимфните възли, дермата и подкожната тъкан.

Съществуват многобройни методи за диагностика на лимфедем, които са фокусирани най-вече върху оценка на отока или съдържанието на вода. Оптичната микроскопия позволява да се открие вариация на фината тъканна структура, което е много полезно за диагностика на лимфедем.

Процесът на визуализация на тъканите с помощта на еднофотонно взаимодействие обикновено се ограничава до излъчване извън фокуса; това ограничение се преодолява до голяма степен при конфокалната микроскопия, използвайки точкова апертура за филтриране на фокусираните фотони.

Използвайки двуфотонно възбуждане, е възможно да се получат оптични сечения в три измерения без диафрагма в области над и под фокалната равнина поради използването на дължина на вълната, двойно по-голяма, отколкото при конфокалната микроскопия.

Феноменът на двуфотонното възбуждане е теоретично разработен преди около век, но експериментално е потвърден едва след появата на лазери. Двуфотонното възбуждане възниква, когато два фотона се абсорбират едновременно в едно квантово събитие. В този случай едновременността се отнася до събития, интервалът между които е много малък, около 10-18 секунди. За да се осигури достатъчен брой фотони, поглъщащи едновременно, плътността на фотоните трябва да бъде милион пъти по-голяма, отколкото при еднофотонната абсорбция. По този начин се изискват мощни лазери за генериране на достатъчна двуфотонна флуоресценция. Освен това двуфотонните процеси имат свойството да генерират множество хармоници, по-специално ефектът от генерирането на втора хармоника (SHG), който позволява допълнително да се изследват конкретни обекти.

Методите за диагностика на заболявания, базирани на мултифотонната микроскопия, не засягат обекта на лъчение и също така позволяват получаване на изображения в почти реално време с субмикронна резолюция. 2,3,4

Методите за двуфотонна микроскопия се използват широко при изследването на биологични обекти, по-специално на кожата, тъй като е възможно да се изследват такива обекти не само на повърхността, но и на дълбочина, без да се привличат допълнителни флуорофори само чрез ендогенна автофлуоресценция. Така че, когато се изследва папиларният слой на кожата и дермата, е възможно да се визуализират ендогенните еластинови флуорофори с помощта на автофлуоресценция (AF) и колагенът с използване на второ хармонично поколение, т.е. основните компоненти на дермата, чието съотношение е отговорно за състоянието на кожата. 5,6 Друг начин за анализ на получените данни е да се изследва степента на дезорганизация на колагена. Тъй като втората хармоника позволява визуализация на колаген, става възможно да се оцени дезорганизацията на колагена. Както беше отбелязано по-горе, дезорганизацията на пространствената структура на колагена в тъканите е биомаркер на редица заболявания, включително лимфедем. Бяха обсъдени различни подходи за оценка на дезорганизацията на колагена. 7,8

Друг начин за оценка на тъканната структура е използването на флуоресцентна образна микроскопия през целия живот (FLIM). Този подход позволява да се оцени пространственото разпределение на няколко флуорофорни молекули едновременно. 9,10 Например, FLIM осигурява измерване на съдържанието на NADH и FAD. 11.

Тази статия обсъжда способността на изображенията на AF и SHG сигнали за оценка на състоянието на кожата по време на развитието на лимфедем.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Първата стъпка беше свързана с развитието на модела на лимфедем. Използвани са 30 глави мъжки плъхове Wistar на възраст 8-10 седмици (тегло 200-250 g). Плъховете се държат в изолирана вентилирана стая на вивариум на Института по биология и биофизика, Томски държавен университет. Температурата в стаята се поддържаше на 20 ± 2,0 ° C, влажността на въздуха беше 60% (и условията на 12 часа светлина/12 часа тъмнина). Всички животни бяха маркирани и държани в продължение на 7 дни в карантина за 5 плъха в една и съща клетка, със свободен достъп до вода и храна (стандартна диета за плъхове). Всички експериментални процедури бяха одобрени от Комисията по етични правила на Томския държавен университет. Като модел за развитие на лимфедем е използвана техниката, описана в референция 12. Тази техника се основава на резекция на подколенния възел на едната лапа на животното, втората лапа е използвана за контрол.

Измерванията бяха получени с многофотонен микроскоп MPTflex (фигура 1) двуфотонен микроскоп (Jenlab, Германия). Пространствената разделителна способност на устройството е около 1 μm по равнината XY и ∼ 2 μm по оста Z. Дължината на лазерната вълна е 760 nm, дълбочината на сканиране е избрана от 0 до 110 μm. Данните за AF и SHG сигналите са записани в решетка 512x512 пиксела, размерът на сканиращата област е 70x70 μm.

Фигура 1.

MPTflex микроскоп от JenLab (Германия).

За да се намали влиянието на шумовия компонент и да се увеличи точността на оценката на данните, се използва разделянето на получените изображения на блокове. Схемата за разделяне на изображения на блокове е показана на Фигура 2, където л е броят на пикселите в изображението, з е броят на пикселите в блока. Използвахме дял в непресичащи се блокове, така че една и съща площ не беше взета под внимание два пъти. Блоковете с ниска интензивност бяха филтрирани.

Фигура 2.

Пример за пространствено разпределение на AF и SHG за здрава тъкан (а), пример за разделяне на изображение на блокове (b).

Интензивността на SHG и индексът на стареене на дермата от SHG към AF (SAAID) е неинвазивен обектен параметър за определяне на състоянието на колаген в дермата, който може да се използва за описване на стареенето в различни области на кожата в - vivo, 13 и също така дава възможност за откриване на увредени или кожни с патологии. 14 Индекс SAAID се определя по формулата

Така че, използвайки метода на плъзгащия прозорец, ние оценихме индекса SAAID за всеки блок и изградихме хистограма на разпределението на индекса. Ширината на блока е избрана от метода за търсене и е равна на 32 пиксела.

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЯ

Изградихме разпределенията на SAAID и AF/SHG за блоковете в относителни единици, използвайки нормализиране на общия брой блокове. Броят на блоковете, които бяха анализирани ∼ 10 хиляди за здрава тъкан и същата стойност беше за тъкан с лимфедем. Резултатите от изчислените разпределения са показани на фигура 3.

Фигура 3.

Хистограми на индекса SAAID за изображения на здрава и лимфедематозна тъкан (c)

Според Фигура 3 (а) средният индекс SAAID за тъкан с лимфедем е малко по-висок. Леката разлика между здрава тъкан и тъкан с лимфедем може да се дължи на факта, че лимфедемната тъкан има както здрави зони, така и зони с оток. Увеличаването на разсейването на стойностите за съотношението AF/SHG приказки (Фигура 3 (b)).

По този начин е показано, че се появява разлика в разпределението на индекса на стареене и съотношението AF/SHG дори в ранните етапи на лимфедема.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Тези резултати демонстрират увеличаване на ширината на съотношението AF/SHG на разпределение и като цяло увеличаване на максимума на съотношението SAAID. По този начин може да се заключи, че промените в разпределението са причинени от промени в структурата на тъканта. За здрава тъкан няма региони със стойности на SAAID по-големи от 1,1, докато за увредената тъкан тези промени са систематични. Този подход е лесен за изпълнение и не изисква сложни изчислителни решения.

По-нататъшните изследвания в тази област ще бъдат фокусирани върху изучаването на разпределението на живота на автофлуоресценцията и изследването на ориентацията на структурата на колагена за по-подробен анализ на получените изображения.

ПРИЗНАВАНИЯ

Работата е извършена като част от Програмата за основни научни изследвания на Държавните академии на науките за 2013–2020 г., ред III.23. Изследването е проведено с финансовата подкрепа на Руската фондация за фундаментални изследвания и Администрацията на Томска област в рамките на изследователския проект № 18-42-703012