Роли Концептуализация, Официален анализ, Разследване, Методология, Администриране на проекти, Софтуер, Визуализация, Писане - оригинален проект, Писане - преглед и редактиране

микробиоми

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, NomNomNow, Inc., Оукланд, Калифорния, Съединени щати

Концептуализация на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отдел за изследвания и развитие на партньорствата, NomNomNow, Inc., Оукланд, Калифорния, Съединени щати, Департамент по сравнителна, диагностична и популационна медицина, Университет на Флорида, Гейнсвил, Флорида, Съединени щати

Разследване на роли, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, NomNomNow, Inc., Оукланд, Калифорния, Съединени щати

Роли Куриране на данни, разследване, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, NomNomNow, Inc., Оукланд, Калифорния, Съединени щати

Роли Куриране на данни, разследване, ресурси, писане - преглед и редактиране

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, NomNomNow, Inc., Оукланд, Калифорния, Съединени щати

Концептуализация на роли, куриране на данни, разследване, ресурси, надзор, писане - преглед и редактиране

Отдел за изследвания и развитие на партньорството, NomNomNow, Inc., Оукланд, Калифорния, Съединени щати

  • Aashish R. Jha,
  • Джъстин Шмалбърг,
  • Джираю Танпрасерцук,
  • Лий Ан Пери,
  • Дан Маси,
  • Райън У. Хонакър

Фигури

Резюме

Ролята на чревните микробиоми като важни регулатори на здравето на бозайниците все повече се признава, въпреки че котешките и кучешките микробиоми остават слабо характеризирани. В това проучване с доказателство за концепция, ние оценихме полезността на директния към потребителя подход за извършване на изследвания за микробиоми на домашни любимци. Ние характеризирахме чревните микробиоми на 238 домашни любимци (46 котки и 192 кучета) чрез генериране

Цитат: Jha AR, Shmalberg J, Tanprasertsuk J, Perry L, Massey D, Honaker RW (2020) Характеризиране на чревните микробиоми на домашни домашни любимци в Съединените щати, използвайки директен подход към потребителя. PLoS ONE 15 (2): e0227289. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227289

Редактор: Саймън Ръсел Клег, Университет в Линкълн, ОБЕДИНЕНОТО КРАЛСТВО

Получено: 20 август 2019 г .; Прието: 16 декември 2019 г .; Публикувано: 20 февруари 2020 г.

Наличност на данни: Необработените fastq файлове са достъпни от базата данни Qiita (Проект 12861) и от ENA (Номер за присъединяване към проучването PRJEB36049). Данните от проучването и таблиците на OTU са налични като обект на phyloseq във файл S2.

Финансиране: NomNomNow, Inc. предостави подкрепа под формата на заплати за автори [ARJ, JS, JT, LP, DM, RWH], но нямаше никаква допълнителна роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа. Конкретните роли на тези автори са формулирани в раздела „авторски приноси“.

Конкуриращи се интереси: Всички автори са служители на NomNomNow, Inc. Членовете на изследователския екип на NomNomNow са служители и притежават акции или опции за акции в NomNomNow, Inc. Няма патенти, продукти в процес на разработка или предлагани на пазара продукти, които да бъдат декларирани. Това не променя придържането ни към политиките PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

В червата на бозайниците има безброй микроорганизми, които са известни като микробиота. Каталогът на микробите и цялото им геномно съдържание в определена среда е известен като микробиом. Последните проучвания при хора показват, че чревният микробиом се влияе от начина на живот, вероятно поради разликите в диетата и околната среда, свързани с издръжката на човека [1–4], и че той играе важна роля за здравето и болестите [5–7]. Има много сходства между микробиомите на хора и домашни любимци [8] и нововъзникващи доказателства сочат, че чревната микробиота може да действа и като важен регулатор на здравето и болестите при домашните домашни любимци [9–12]. Например, антибиотиците, както и хранителните съставки, които се различават в зависимост от търговските храни, оказват влияние върху чревните микробиоми при домашните любимци [10,13]. Освен това, микробният дисбаланс на червата (дисбиоза) при домашните любимци може да доведе до намалено производство на късоверижни мастни киселини, което може да допринесе за развитието на хронични възпалителни състояния [14].

Здравето на домашните любимци е важна и нововъзникваща област на научните изследвания. Кучетата и котките наброяват общо 135 милиона, а общите годишни ветеринарни разходи надхвърлят 17 милиарда долара в САЩ [15]. По-голямото разбиране на микробиомите за домашни любимци има потенциал да осветли нови аспекти на физиологията на гостоприемника и етиологията на заболяванията, които могат да доведат до развитието на терапевтични средства, включително, но не само диетични добавки, пробиотици и постбиотици [16–19]. Съществуващите изследвания на микробиоми за домашни любимци имат няколко ограничения. Първо, много проучвания са склонни да имат ограничени размери на пробите (trimLeft = c (10, 10), maxN = 0, maxEE = 2, truncQ = 2) и вариантите на последователността бяха изведени чрез обединяване на четения от всички проби (пул = TRUE). След това бяха създадени таблици на Amplicon Sequence Variant (ASV) чрез обединяване на сдвоени четения и беше присвоена таксономия с помощта на обучителния набор RDP v14 [81].

Генерирани са приблизително 11,5 милиона обединени четения и първоначално са идентифицирани 27 104 ASV. След качествен контрол и отстраняване на химера, 95% от показанията (дълбочина = 10 902 218) и 5 ​​052 таксона останаха. От тях малка част от таксоните (31 ASV) принадлежат на неизвестна бактериална фила и няколко допълнителни фили присъстват в по-малко от 5% от пробите, а именно: Aquificae, Chlamydiae, Crenarchaeota, Deferribacteres, Euryarchaeota, Nitrospirae, Planctomycetes, Spirochaetes, SR1 и TM6. Премахването на тези таксони доведе до 10 901 731 четения и 5 007 таксони. След тези мерки за контрол на качеството средната дълбочина на вземане на проби за проба е била 45 806 (SD ± 22 325). Всяка проба съдържа най-малко 13 679 четения и максималното покритие е 94 183 четения. Следователно окончателният набор от данни включва 10 901 731 четения, принадлежащи на 5 007 бактериални таксона в 238 проби.

статистически анализи

Две метрики на алфа разнообразието, а именно богатството на видовете и индексът на разнообразието на Шанън, бяха изчислени чрез разреждане на пробите на различни дълбочини, започвайки от 1 000–13 500 последователности на проба чрез увеличаване на дълбочината на секвениране с 500 четения. На всяка дълбочина бяха извършени сто повторения и средните стойности бяха използвани като оценка на тези мерки във всяка проба. Тестовете на Крускал – Уолис бяха използвани за оценка на значимостта на разликите във всяка от метриките на алфа разнообразието между видовете домашни любимци при всяка дълбочина на разреждане.

Разликите в различията между видовете домашни любимци са по-изразени на по-фини таксономични нива

Кривите на разреждане, генерирани с помощта на тези отчитания, разкриват, че дълбочината на секвениране, която постигнахме, достатъчно насити бактериалното разнообразие както при котки, така и при кучета (фиг. 1А). След това използвахме две често използвани мерки за характеризиране на видовото разнообразие - видово богатство и индекс на разнообразие на Шанън - в кучешките и котешките черва. Изчислихме бактериално разнообразие на кучета и котки при различни дълбочини на разреждане, вариращи от 1 000 до 13 500 четения. И двете показатели за бактериално разнообразие на червата са по-високи при котките, независимо от дълбочината на разреждане (P Фиг. 1. Сравнение на бактериалното разнообразие в кучешките и котешките черва.

(А) Крива на разреждане, показваща разликите в алфа разнообразието между котки и кучета. Лентите за грешки представляват стандартни отклонения. (Б) Брей-Къртис разстояния между котки и кучета (червено), в рамките на котки (аквамарин) и в рамките на кучета (злато). Баровете представляват стандартни грешки на средната стойност. Най-голямата междувидова разлика се наблюдава на ниво ASV и е значително по-голяма от двете вътрешновидови разстояния.

След това оценихме разликите в чревния бактериален състав между котки и кучета, като използвахме разстоянието Bray-Curtis на всяко таксономично ниво. Междувидовото разстояние не се различава визуално от вътрешновидовите разстояния на по-високи таксономични нива (т.е. тип, клас и ред; Фиг. 1В). Въпреки това, на по-фини таксономични нива (т.е. семейство, род и ASV), междувидовото разстояние изглежда е станало значително по-голямо от вътрешновидовите разстояния. Разликата между междувидовите и вътрешновидовите разстояния е най-голямата на ниво ASV и не се изравнява, което показва, че може да има допълнителни вариации при по-фини таксономични детайли (ниво на щам или субстейн). Независимо от това, на ниво ASV, междувидовото разстояние е значително по-голямо от двете междувидови разстояния (FDR коригирано P Фиг. 2. Вариации на чревния микробиом между котки и кучета.

(А) PCoA от разстоянието Bray-Curtis разкрива разделяне между чревните микробиоми на котки и кучета на ниво ASV. Графиките в кутиите подчертават разликите между видовете по PCoA1. Точките представляват индивиди, а цветовете показват видове. (Б) Топлинна карта, показваща 83 таксона със значително различно изобилие между кучешки и котешки популации с индивиди в колони и таксони в редове. Цветовете представляват относително изобилие. 83 таксона, включени в този парцел за отопление, са изброени в таблица S5.

Също така използвахме машинно обучение (произволна гора) като алтернативен подход за оценка на разликите между бактериалните състави на кучетата и котките. Класификатор на произволни гори успя да категоризира индивидите към съответните им видове с висока точност (точност = 96%; 95% CI = 88%, 99%; AUC = 0,99, S3B Фиг. И S4 Таблица). Над 96% от кучетата (N = 132 от 134 в данните за обучение и 57 от 59 в комплекта за валидиране) са правилно класифицирани като кучета и над 81% от котките (N = 26 от 32 в данните за обучение и 12 от 13 в комплекта за валидиране) също са правилно идентифицирани като котки (таблица S4). Следователно тези открития съвместно показват, че бактериалният състав на кучешките и котешките черва се различава значително.

Разлики в бактериалните таксони на червата между кучешки и котешки проби

Чревни бактериални вариации в кучешки и котешки проби

Предишните анализи, изследващи междувидовите разлики в бактериалния състав на червата и съдържанието на таксони (Фиг. 2), също показват, че може да има значителни микробни вариации в кучетата. За да проверим тази хипотеза, първо извършихме PCoA изключително върху 192 кучета в нашия набор от данни, което разкри ясна структура (Фигура 3А). За да определим оптималния брой кучешки групи, извършихме клъстер чрез анализ на ординацията, използвайки горните три оси PCoA (S5A Фиг.) [80]. Добротата на групирането, оценена с помощта на статистика за „пролука“, разкрива три кучешки клъстера (клъстери I, II и III; S5B Фиг.). След отчитане на партидните ефекти, чревният бактериален състав се различава значително между трите клъстера (P Фиг. 3. Вариации на чревния микробиом в кучетата.

(А) Анализът на PCoA с използване на разстояния на Bray-Curtis разкрива значителни вариации в микробиома на кучешките черва на ниво ASV. И трите клъстера се различават значително по PCoA1, но само клъстер 3 се различава значително по PCoA2. *** показва P 1.5, GLM и горната 10% опашка с променлива важност при случайния анализ на горите, Фигура 3C). По-голямата част от бактериите, отличаващи кучешките клъстери, принадлежат към рода Bacteroides (80%, N = 55 от 68, таблица S6).

Фактори, свързани с бактериални вариации на кучешките черва

(А) Разликите в алфа разнообразието между кучета, пребиваващи в различни географски региони в САЩ (вляво) и между големи и малки кучета (вдясно). (Б) Разлики в кучешкото бета разнообразие в САЩ и между големи и малки кучета по PCoA1, получени от 92 кучета, за които са налични допълнителни данни от анкетни анкети.

Дискусия

Много от нашите резултати са в съответствие с предишни изследвания, проведени в академични лаборатории. Установихме, че Firmicutes, Proteobacteria и Bacteroides са най-разпространените бактерии както в микробиомите на котките, така и в кучетата, което е в съответствие с предишни проучвания [22–24,32,92,93]. Фирмикутите, протеобактериите и бактероидите представляват 45% (Q1 = 22%, Q3 = 66%), 32% (Q1 = 3%, Q3 = 52%) и 15% (Q1 = 1%, Q3 = 23%) от чревните бактерии при кучета и те съставляват 38% (Q1 = 21%, Q3 = 59%), 37% (Q1 = 3%, Q3 = 62%) и 14% (Q1 = 4%, Q3 = 22%) при котки, също сравними с докладваните по-рано пропорции. [22–24,32,92,93]. Сравнителните анализи показаха, че бактериалният състав на кучешките и котешките черва се различава значително. Открихме значително по-високо алфа разнообразие при котките спрямо кучетата, което също потвърждава по-ранни открития [47,53]. Следователно, заедно тези открития разкриват, че прилаганият тук DTC подход дава резултати, сравними с тези, получени при използване на стандартни техники в лабораторията.

В допълнение към възпроизвеждането на предишни констатации, това проучване разкрива нови прозрения в микробиомите на червата на домашните любимци. Многобройни проучвания показват, че както диетата, така и околната среда могат да повлияят на чревните микробиоми и е възможно видовете, съжителстващи в обща среда, да имат висока степен на сходство в чревните микробиоми [1,3,8]. Нашите резултати показват, че въпреки общата среда, чревните микробиоми на кучета и котки се различават значително един от друг. Алфа разнообразието е по-високо при котките спрямо кучетата, въпреки че двигателите на тази разлика остават да бъдат идентифицирани. Докато диетичните и поведенческите различия са обичайните заподозрени, разликите в обема на червата също могат да обуславят микробните различия между тези домашни любимци [94,95]. Освен това, ние наблюдавахме най-големите междувидови разлики на ниво ASV, без да се изравняваме, което показва, че малки генетични вариации в бактериалните популации, като тези, наблюдавани между бактериални щамове или субстенове, разграничават кучешки и котешки проби в това проучване.

В допълнение към наблюдаваните междувидови различия, нашите анализи категорично подкрепят наличието на значителни нива на бактериални вариации в червата (както алфа, така и бета разнообразие) при кучета в това проучване. Въз основа на техните чревни микробиоми успяхме да открием три различни кучета кучета. Любопитното е, че не сме наблюдавали натрупване на микробиоми в червата при котки. Липсата на групиране при котки може да се дължи на по-малкия размер на извадката от котешки участници в това проучване. Като алтернатива, големите разлики в обема на кучешките черва могат да допринесат за изразени разлики в чревните микробни вариации при кучета [94,95], докато липсата на забележими вариации в размерите на котешкото тяло може да допринесе за липсата на групиране при котки. Необходима е допълнителна работа, за да се определят двигателите на такова групиране при кучета и тяхното биологично значение.

Тъй като подходът DTC може да заобиколи много от препятствията при придружаващите проучвания върху животни, той може да бъде много полезен при изучаване на ефекта от микробиомите на домашни любимци върху здравето и болестите в бъдеще. По-големите кохортни размери, сглобени с помощта на DTC подход, в идеалния случай ще могат да свързват микробиомите със специфични здравни черти при домашните любимци. Идентифицирането на специфични за признаците микробни щамове, функции и метаболити може да информира за развитието на нови здравни продукти за домашни любимци (напр. Пробиотици) и лечения (напр. Микробни лекарства, постбиотици) при домашни любимци [16,97]. Освен това, като се има предвид, че тези домашни любимци споделят обща домашна среда с хората и имат общи чревни бактерии, по-доброто разбиране на микробиомите за домашни любимци има потенциал да осветява нови връзки между микробиома и човешките заболявания [8,12,63,69,97–100].

Заключения

Това доказателство за концепция проучване показва, че DTC подходът за изучаване на микробиоми на домашни любимци заобикаля много от предизвикателствата, налични във ветеринарните изследвания, като същевременно дава сравними констатации, както и нови прозрения. Използвайки 16S rDNA секвениране на 192 кучета и 46 котки, ние не само показваме различия в чревния микробиом между тези два вида, но също така демонстрираме значителни вариации на чревния микробиом в рамките на пробите кучета и че географията и телесното тегло могат да бъдат свързани с разнообразието на кучешки микробио както и композицията. Въпреки тези констатации, прозренията за микробиомите на домашни любимци, получени от 16S рДНК, са ограничени и препоръчваме бъдещите проучвания да изследват метагеномични подходи, които могат да предоставят данни за нивото на щама, както и функционални характеристики на чревните бактерии.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Контрол на качеството на данните за последователността 16S.

(А) Общ брой четения в необработените данни. (Б) Първоначално идентифицирахме 23 известни phyla в набора от данни, както и някои бактерии, които не могат да бъдат причислени към известни phyla въз основа на тяхната 16S rDNA. Много от тези фили бяха обхванати от малко четения и присъстваха само в по-малко от 5% от изследваните проби и поради това бяха отстранени. (° С) Премахването на такива слабо разпространени таксони не доведе до значителни загуби в дълбочините на секвениране. (Д) Разпространение на 13-те останали фили между индивиди (оста y) и тяхното изобилие в набора от данни (ос x).

S2 Фиг. Разлики в нивата на филум между котки и кучета.

Относителното изобилие от актинобактерии е по-високо в котешките черва, а Fusobacteria - в кучешките.

S3 Фиг. Сравнение на кучешки и котешки микробиоми.

(А) Крива на разреждане, показваща разликите в алфа разнообразието между котки и кучета, използващи индекс на разнообразието на Шанън. Лентите за грешки представляват стандартни отклонения. (Б) Ефективност на случайния класификатор на горите (на ниво ASV), оценен с помощта на ROC криви (котка: тюркоаз, куче: оранжево). AUC = 0,99 и за двете. (° С) Идентифициране на диференциално богати ASV, използвайки log2 пъти промяна и променлив коефициент на важност (мащабиран до 100).

S4 Фиг. Сравнение на микробиомите в червата, използвайки разстояния UniFrac.

(A-B) Сравнение на микробиома на кучета и котки при използване на разстояние UniFrac (отгоре) и претеглено разстояние UniFrac (долу). (C-D) Сравнение на чревния микробиом в трите кучешки клъстера, използвайки разстояние UniFrac (отгоре) и претеглено разстояние UniFrac (отдолу). Всички P-стойности са получени от PERMANOVA, използвайки 10 000 пермутации.

S5 Фиг. Вътрешновидови вариации в микробиома на кучешките черва.

(А) График на сипея, показващ собствените стойности за първите 20 оси PCoA. (Б) Статистика за пропуски, получена от PAM клъстериране, използвайки най-добрите 3 PCoA оси и 1000 реплики за зареждане. (° С) Брей-Къртис разстояния в (бяло) и между (сиво) трите котешки клъстера. И в трите случая разстоянията в рамките на клъстера бяха по-малки от разстоянията между групите. (Д) ROC криви, оценяващи модела на случаен класификатор на гората за предсказване на котешки клъстери.

S6 Фиг. Вътрешновидови вариации в микробиома на котешките черва.

Нито анализът на PCoA (А) нито статистиката за разликата, получена от PAM клъстериране (Б) разкриха различни клъстери при котки. Изпълнихме 1000 реплики за зареждане за клъстериране, използвайки горните 3 PCoA оси (° С).