Показатели: PDF 1082 преглеждания | HTML 1615 изгледи | ?

отварата

Mingzhe Zhu, Shijun Hao, Tao Liu, Lili Yang, Peiyong Zheng, Li Zhang _ и Guang Ji

Резюме

Mingzhe Zhu 1, 2, *, Shijun Hao 1, *, Tao Liu 1, Lili Yang 1, Peiyong Zheng 1, Li Zhang 1 и Guang Ji 1

1 Институт по храносмилателни болести, Китайско-канадски център за изследване на храносмилателни заболявания, Шанхайски университет по традиционна китайска медицина, Шанхай, Китай

2 Колеж за обществено здраве, Шанхайски университет по традиционна китайска медицина, Шанхай, Китай

* Авторите са допринесли еднакво за тази работа

Ключови думи: Lingguizhugan отвара, генна експресия, безалкохолна мастна чернодробна болест, RNA-Seq

Получено: 07 юни 2017 г. Прието: 29 юни 2017 г. Публикувано: 28 юли 2017 г.

ВЪВЕДЕНИЕ

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е една от водещите причини за хронични чернодробни заболявания по целия свят, която се характеризира с натрупване на мастни натрупвания в черния дроб в резултат на причини, различни от злоупотребата с алкохол [1, 2]. Разпространението на NAFLD се увеличава поради съвременния заседнал и обилен начин на живот, който е 20-30% в западните страни и 15-20% в Китай [3, 4]. Важно е, че NAFLD е едно от най-опасните усложнения, които могат да доведат до тежки чернодробни патологии, включително фиброза, цироза и хепатоцелуларен карцином [5, 6]. В допълнение, натрупването на доказателства показва, че рисковете от NAFLD се простират отвъд черния дроб и са свързани с редица хронични заболявания като сърдечно-съдови заболявания, хронични бъбречни заболявания и захарен диабет тип 2 [7, 8].

Развитието на NAFLD е свързано с няколко фактора като възраст, пол, етническа принадлежност, наличие на сънна апнея и нарушения на ендокринната система (например хипотиреоидизъм, хипопитуитаризъм, хипогонадизъм и синдром на поликистозните яйчници). Разпространението на NAFLD се увеличава с възрастта и е по-често сред мъжете на възраст 45-65 години. Също така се разпространява бързо сред децата заедно с епидемиите от затлъстяване [9]. По този начин NAFLD се превърна в основен глобален здравен проблем и донесе тежко бреме на пациентите и обществото.

Механизмите, участващи в развитието на NAFLD, все още се обсъждат, въпреки че са предложени няколко хипотези [10–12]. Проучванията разкриват, че участват различни сигнални пътища като ядрен фактор κB (NF-κB), AMP-активирана протеин киназа (AMPK), Toll-подобен рецептор (TLR) и фосфатидилинозитол 3- киназа/протеин киназа B (PI3K/Akt) в напредъка на NAFLD. Тези сигнални пътища са свързани помежду си, за да образуват мрежа, като блокирането на някой от тях може да не е ефективно за предотвратяване или лечение на NAFLD [13]. Всъщност няма установена стандартна терапия за NAFLD. Международните насоки препоръчват промените в начина на живот като основни стратегии, предложени за пациенти с НАЖБП. Необходима е обаче фармакологична намеса, когато заболяването е прогресиращо или сериозно. Напоследък са въведени много допълнителни терапии, особено билкови лекарства за лечение на NAFLD [14].

За да подобрим нашето разбиране за механизмите под ефикасността на Lingguizhugan отвара, ние приложихме HFD индуцирани NAFLD плъхове и първо открихме профила на експресия на гена на целия чернодробен ген чрез анализ на RNA-Seq. Настоящото проучване може да хвърли нова светлина върху разбирането на научната конотация на традиционния китайски терапевтичен принцип при NAFLD и да предостави повече възможности за лечение на NAFLD и кандидат-цели за клинична терапия на NAFLD в бъдеще.

РЕЗУЛТАТИ

Фенотипни характеристики на плъховете

HFD индуцирана стеатоза, която е типичната характеристика на NAFLD в чернодробни секции, както е показано чрез оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и оцветяване с Oil Red O (Фигура 1I), значително повишен чернодробен TG (Фигура 1H) при плъхове с NAFLD е в съответствие с хистологична промяна. Телесното тегло (фигура 1А), чернодробният индекс (фигура 1В), съотношението на епидидималната мастна тъкан и телесното тегло (EFP/BW, фигура 1C), общия серумен холестерол (TC, фигура 1D), серумната аспартат аминотрансфераза (AST, фигура 1G) са също се е увеличил драстично при плъхове NAFLD, но серумният TG (Фигура 1Е) и алмандин аминотрансферазата (ALT, Фигура 1F) не показват значителна разлика между групите. След 4 седмици Lingguizhugan лечение с отвара, стеатозата е отслабена (Фигура 1I) и съдържанието на чернодробен TG е значително намалено (Фигура 1Н). Чернодробният индекс, съотношението EFP/BW (фигура 1C), серумната TC (фигура 1D), TG (фигура 1E) и AST (фигура 1G) също са значително намалени при Lingguizhugan интервенция с отвара, докато телесното тегло (Фигура 1А) и серумният АЛАТ (Фигура 1F) не реагират на интервенцията.

Фигура 1: Фенотипните характеристики на плъховете Мъжки мишки C57Bl/6 са били хранени или с диета (нормално, n = 7), HFD (n = 7) или HFD с Lingguizhugan отвара, прилагана (n = 7) в продължение на 4 седмици. Плъховете бяха умъртвени и бе събрана чернодробна тъкан и серум. Записано е телесно тегло (А), индекс на черния дроб (Б), Съотношение на теглото на епидидималната мастна тъкан (° С) бяха изчислени. Серум TC (Д), TG (E), ALT (F), AST (G) са анализирани, съдържанието на TG в черния дроб (H) беше открит и чернодробните секции бяха оцветени както с H&E, така и с масло Red O (I) (увеличение на изображението × 200). Данните присъстваха като средно ± SD. Зелени барове, lingguizhugan отвара намеса група; сини ленти, HFD индуцирана NAFLD група; черни ленти, нормална група. Две сравнени групи бяха маркирани с линия и статистическата информация беше дадена като стр 0,05.

Диференциално изразени генни профили

Използване на граничната скорост на фалшиво откриване 1.2 (регулирана нагоре) или Фигура 2: Йерархичен клъстер за припокриващи се диференцирано експресирани гени Всички съответни гени бяха групирани чрез йерархично клъстериране въз основа на експресионни стойности (log2 съотношения) във всички проби. Пробите се показват в колони, а гените в редове. Генната експресия е представена като цвят, с по-ярко червено за по-високи стойности и по-ярко зелено за по-ниски стойности.

Анотация на гените и функционален анализ

Фигура 3: Обогатяване на пътя на GO и KEGG Обогатяването на пътя на GO и KEGG бяха анализирани от Дейвид 6.8. Термини на GO (биологичен процес), обогатени за припокриващи се диференциално експресирани гени (А) Обогатяване на пътя на KEGG за припокриващи се диференциално експресирани гени (Б).

Таблица 2: Припокриването на обогатяване на диференциално експресирани гени

Име на пътя на KEGG

Гени, обогатени по пътя

FN1, Col3a1 Actn4, Pik3r1

AMPK сигнален път

Foxo1, Foxo3, Scd1, Pik3r1

Сигнален път на FoxO

Foxo1, Foxo3, Bcl2l11, Pik3r1

PI3K-Akt сигнален път

Bcl2l11, Col3a1, Fn1, Foxo1, Foxo3 и Pik3r1

Fn1, Col3a1, Actn4, Pik3r1

Foxo1, Ppp1r3c, Pik3r1

Сигнализиращ път за инсулин

Foxo1, Ppp1r3c, Pik3r1

Биосинтез на ненаситени мастни киселини

Пътеки при рак

Foxo1, Fn1, Fzd1, Pik3r1

Протеогликани при рак

Fn1, Fzd1, Pik3r1

Регулация на актинов цитоскелет

Fn1, Actn4, Pik3r1

Мрежа за протеиново-протеиново взаимодействие (PPI) за припокриващите се гени

PPI мрежа от припокриващите се диференциално експресирани гени е изградена от Cytoscape на базата на базата данни BioGRID. Хъбовите протеини показват, че връзката между възлите е строго установена. Както е показано на Фигура 4, наблюдавахме, че 23 диференцирано експресирани гени, кодиращи протеини, са включени в мрежата като Foxo1, Foxo3, PIK3R1, FN1, BCL2L11 и COL3A1, от които PIK3R1 е най-важният хъб протеин.

Фигура 4: PPI мрежа за припокриващите се диференциално експресирани гени. Жълтите възли представляват припокриващи се диференциално експресирани гени, кодиращи протеини, които взаимодействат с предсказаните протеини (сини възли).

ДИСКУСИЯ

В настоящото проучване, прилагайки анализ на RNA-seq, ние го наблюдаваме Lingguizhugan отварата може да подобри фенотипните характеристики на NAFLD и да промени партида генна експресия. Чрез извличане на литература открихме, че повечето от идентифицираните диференциално експресирани гени са свързани с NAFLD. Освен това, използвайки комбинацията от генна анотация, GO, KEGG път и PPI мрежов анализ, забелязахме, че повечето от гените, променени от Lingguizhugan отвара са гените на инсулинова резистентност и липиден метаболизъм.

Scd1 е ограничаващ скоростта ензим, катализиращ синтеза на мононенаситени мастни киселини, които са основни компоненти на липидите в тъканите. Доказано е, че Scd1 е решаващ фактор в липидния метаболизъм като критична контролна точка, регулираща чернодробния липиден синтез и β-окисление [32]. Генетичната делеция на Scd1 предпазва от развитието на мастна чернодробна и инсулинова резистентност при мишки. Освен това антисмислените нуклеотидни инхибитори срещу чернодробна Scd1 предотвратяват индуцирана от HFD чернодробна стеатоза, а за Scd1 инхибиторите се твърди, че са нови лечения за NASH [33]. Нашите открития в настоящото проучване са в съответствие с тези данни, което показва Lingguizhugan отварата може да намали Scd1 и да предотврати развитието на NAFLD. По-нататъшното разследване на механизмите на регулиране на Scd1 може да помогне за намирането на нови лекарства за лечение на NAFLD.

Освен това забелязахме, че някои други гени като Col3a1 и Fn1 са значително регулирани от Lingguizhugan отвара. Col3a1 транскрибира в колаген алфа-1 (III) верижен протеин, който е предшественик на колаген III, докато Fn1 кодира гликопротеин фибронектин, лигандът на компонентите на извънклетъчната матрица. Тези два гена участват активно в процеса на фиброза. За отбелязване е, Zhang X, et al [34] съобщават, че диосцинът проявява мощни ефекти срещу чернодробна фиброза чрез модулация на експресията на Col3a1. Chen G, et al [35] установяват, че госипол подобрява чернодробната фиброза и намалява нивата на Col3a1 и Fn1. Bai Q, et al [36] съобщават, че ацетаминофен хепатотоксичен метаболит, повишена клетъчна експресия на иРНК на Col3a1 и индуцирана чернодробна фиброза. Всички тези данни предполагат, че Col3a1 и Fn1 играят важна роля в прогресията на NAFLD и Lingguizhugan отварата може да регулира надолу Col3a1 и Fn1.

Въпреки че понастоящем няма одобрена фармакологична интервенция за NAFLD, серия от агенти са проучени, за да се насочат към свързаните съпътстващи заболявания с различна степен на успех. Сред тях, Orlistat, който предотвратява ентеричната абсорбция на липиди, е насочен към затлъстяването и действа като обратим инхибитор на липазата [37]; Тиазолидиндионите, PPARγ агонистите, са доказано ефективни при повишаване на инсулиновата чувствителност [38]; Понижаващият липидите агент статин се използва най-вече при лечение на дислипидемия и главно регулиране на синтеза на холестерол [39]; Обетихоловата киселина, синтетичен вариант на хенодеоксихолевата киселина, е мощен активатор на ядрения рецептор на фарнезоид X и е потвърдено, че подобрява патологията на NASH [40]. Като формула, съставена от естествени продукти, е разумно това Lingguizhugan отварата е свързана с инсулинова резистентност и липиден метаболизъм.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Изготвяне на Lingguizhugan отвара

Lingguizhugan отварата включва: Пория (основни химикали, съдържащи полизахариди, тритерпени и др.), Ramulus Cinnamomi (основни химикали, съдържащи цинамалдехид, канелена киселина и др.), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (основни химикали, съдържащи атрактилон, полизахариди и др.), и Radix Glycyrrhizae (основни химикали, съдържащи глициризинова киселина, ликофлавон и др.). Съотношението на четирите билки беше 2: 1,5: 1: 1. Всички билки бяха предоставени от болница Longhua, свързана с Шанхайския университет по традиционна китайска медицина. Билковата отвара се приготвя, както е описано по-рано [42].

Животни и диети

Пет седмици мъжки плъхове Wistar (130 g ± 10 g) са получени от Shanghai SLAC Laboratory Animal CO. LTD, Китай, и се поддържат в стая с контролирана температура и влажност. Двадесет и един плъхове бяха разделени на случаен принцип в три групи: нормална група, хранени с диета с чау; Група NAFLD, хранена с HFD (88% диета с чау, 10% свинска мас и 2% холестерол); LGZG група, хранена с HFD и администрирана с Lingguizhugan отвара в доза 10 ml/kg/d

Животните се претеглят и жертват след 4-седмична намеса. Кръвни проби се събират от коремната аорта, центрофугират се при 3000 × g в продължение на 10 минути при 4 ° С и се събират серуми. Чернодробната тъкан бързо се отстранява, изплаква се с 0,9% разтвор на натриев хлорид и се претегля. Бяха получени две парчета чернодробна тъкан (1,0 cm × 1,0 cm × 0,2 cm) от идентичния лоб и позиция, след което бяха фиксирани в 10% неутрално буфериран формалин. Другата чернодробна тъкан се съхранява при -80 ° C след бързо замразяване в течен азот. Всички процедури с животни бяха одобрени от Комитета по етика на експериментите с животни от Шанхайския университет по традиционна китайска медицина

Биохимичен анализ

Серумната алмандин аминотрансфераза (ALT), AST, TG, TC и чернодробната TG бяха изследвани с помощта на търговски комплекти (получени от Института по биоинженерство в Нанкин Jiancheng, Нанкин, Китай) в съответствие с инструкциите на производителя.

Хистопатологично изследване

Чернодробните проби бяха фиксирани в 10% формалин в продължение на 48 часа, вградени в парафин, разделени на 4 μm дебелина, оцветени с H&E, а замразените проби бяха нарязани на 8 μm участъци и оцветени с Oil Red O, всички проби бяха изследвани под светлина микроскоп при увеличение 200 ×.

Откриване на RNA-Seq

Общо РНК бяха изолирани от чернодробни тъкани (7 проби на група), като се използва реагент TRIzol (Invitrogen, САЩ). Качеството на РНК се проверява с помощта на Agilent 2100 Bio-анализатор (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния). Подготовката на библиотеки за cDNA впоследствие се извършва с реагенти, доставени в комплекта за подготовка на проби на РНК TruSeq на Illumina v2, съгласно инструкциите на производителя. Окончателно пречистените библиотеки бяха оценени с помощта на автоматизирана система за електрофореза BioAnalyzer 2100, количествено определена и секвенирана на HiSeq 2000 съгласно стандартния протокол за секвениране на Illumina.

RNA-Seq анализ на данните

За да се получат висококачествени чисти данни за последващ анализ, нискокачествените четения и четения, съдържащи адаптери или ploy-N в сурови данни, бяха премахнати. Чистите показания бяха подравнени с генома на плъхове (Ensembl RGSC3.4), като се използва TopHat v2.1.1. Броят на четенията, картографиран на всеки ген, се отчита чрез HTSeq 0.7.2. Фрагменти на килобаза от транскриптна последователност на милиони секвенирани двойки бази (FPKM) се използва за определяне на изобилието на транскрипция на всеки ген. Анализира се диференциална експресия на три групи (седем биологични повторения на група), използвайки DESeq 2. Честота на фалшиви открития 1.2 или ->