Оригинални статии

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Цитати
  • Метрика
  • Препечатки и разрешения
  • PDF

Резюме

Caractérisation de souches du virus de la laryngotrachéite infectieuse aviaire (VLTI) isolées aux USA par la réaction de polymérisation en chaîne et le polymorphisme de taille des fragments de restriction (PCR-RFLP) de génomiques multiples

характеризиране

Характеризиране на изолатен деинфекциозен вирус на ларинготрахеит (ILTV) от Вереинигтан Staaten mittels Polymerasekettenreaktion und Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (PCR-RFLP) mehrerer Genomregionen

Caracterización de aislamientos de virus de laringotraqueítis infecciosa (ILTV) de Estados Unidos mediante reacción en cadena de la polimerasa y polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (PCR-RFLP) de múltiples regiones del genoma.

Въведение

Материали и методи

Щамове, изолати и вирусно размножаване

В това проучване са използвани седем ваксинални щамове на ILTV: шест ваксини за изпълнителен директор - Biotrach (Intervert Inc., Millsboro, Delaware, USA), Broilertrake-M (American Scientific Laboratories, Inc., Millsboro, Delaware, USA), BioTrach (TrioBio Laboratories, Държавен колеж, Пенсилвания, САЩ), Trachivax (Schering-Plough Animal Health, Kenilworth, New Jersey, USA), Laryngo-Vac (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa, USA), и Fowl Laryngotracheitis Vaccine (Lohmann, Animal Health), Уинслоу, Мейн, САЩ) - и TCO ваксината LT-IVAX (Schering-Plough Animal Health). В това проучване бяха анализирани общо 25 полеви изолати, събрани между 1988 и 2005 г. от девет държави; 22 изолата са получени от търговски домашни птици и три изолата от стада в задния двор (Таблица 1). От 22 търговски изолати от домашни птици, 19 са били извлечени от бройлери и три от стада за разплод на бройлери. Изолатите бяха идентифицирани по номера на пробата, последван от буква (всяка буква представлява различно състояние на произход, от A до I), година на изолация и тип птица, от която бе събран изолатът.

Публикувано онлайн:

Таблица 1. Полеви изолати на вируса на инфекциозен ларинготрахеит, използвани за PCR-RFLP

Всички вируси са изолирани от горните дихателни пътища на птиците и са размножени, както е описано по-горе (Garcia & Riblet, 2001). Накратко, ILTV изолатите се размножават в хориоалантоисната мембрана (CAM) на 9-дневни до 11-дневни яйца с пилешки ембриони без специфични патогени. Ембрионите се инкубират в продължение на 5 дни при 37 ° С и се наблюдават ежедневно. След инкубация САМ бяха изследвани за наличие на плаки, характерни за репликацията на ILTV. Изолираните плаки се смилат в 100 ul фосфатно буфериран физиологичен разтвор и се замразяват/размразяват три пъти. Единични плаки се използват за екстракция на ДНК и се поддържат като вирусен запас при -80 ° C. Референтният щам на ILTV на Министерството на земеделието (USDA) (ATCC # N-71851) се размножава в клетки от бъбреци на пилешки ембрион (CEK), приготвени, както е описано по-рано (Tripathy, 1998), и заразените култури се поддържат при -80 ° C за ДНК добив. Изолирането на вируси от експериментално ваксинирани птици се извършва в пилешки бъбречни клетки от възрастни птици (Hughes & Jones, 1988).

Експерименти с ваксинация

Екстракция на вирусна ДНК

ДНК от полеви изолати се извлича от отделни CAM плаки, докато ДНК от търговските ваксини се извлича директно от ваксинални препарати или от заразени супернатанти на пилешки ембрион с помощта на QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ) според производителя препоръки. ДНК се разрежда в 50 ul буфер за елуиране и се съхранява при -20 ° С.

Праймери и PCR

Някои от праймерите, използвани в това проучване, са избрани от предварително публикувана работа, а други са проектирани с помощта на последователността на генома ILTV (номер за присъединяване на GenBank U28832) със софтуер Primer Select (DNASTAR, Madison, Wisconsin, USA) (Таблица 2). Всички усилвания бяха извършени с помощта на висока точност Platinum Taq ДНК полимераза (Invitrogen). Всяка реакция на амплификация се провежда в 50 ul обем, съдържащ 200 цМ dNTPs, 2 тМ MgS04, 250 цМ всеки праймер, 1 U Taq полимераза, 5 ц1 буфер и 5 цл матрична ДНК. Всички амплификационни реакции използваха начален денатуриращ етап при 94 ° C за 1 min, последван от 35 амплификационни цикъла от 94 ° C за 1 min, с температури на отгряване в диапазона от 54 до 60 ° C (Таблица 2), в продължение на 30 секунди (gM/UL9), 45 секунди (ORF B-TK, ICP4, TK и gD/gI/gE) или 1 минута (UL47gG и UL0/UL-1). Удължаването се извършва при 68 ° C с времената на удължаване, които варират в съответствие с усилването на размера на целевата област (UL0/UL-1, TK и UL47/gG за 3 минути; gM/UL9 за 2 минути; ICP4, gD/gI/gE и ORF B-TK за 7 минути) и окончателно удължаване при 68 ° C за 7 минути (UL0/UL-1, TK, UL47/gG и gM/UL9) или 10 минути (ICP4, gD/gI/gE и ORF B-TK). PCR продуктите бяха разделени чрез електрофореза в 1% агарозни гелове, оцветени с етидиев бромид и изложени на ултравиолетова светлина за визуализация.

Публикувано онлайн:

Таблица 2. Праймери и региони на генома, използвани при PCR-RFLP анализ

RFLP анализ

Резултати

Избор на области на генома и рестрикционни ендонуклеази

От първоначалните седем геномни области и 36 RE тествани, четири геномни региона и 10 RE бяха избрани поради способността им да диференцират представителни щамове и изолати на ILTV в САЩ. Избраните области на генома бяха: ORFB-TK, усвоен с RE BstF5Аз; ICP4, усвоен с REs ХеIII и HinP1Аз (Чанг и др., 1997), Alwаз и АваАз; UL47/gG, усвоен с REs MspАз, АфлII, НлаIV, Fspаз и ХеIII; и gM/UL9 областта, усвоена с RE МвоI. Областите на генома UL0/UL-1, gD/E/I и TK не показват разлики в модела на RFLP с нито един от тестваните RE (данните не са показани).

PCR амплификация на ORFB-TK, gM/UL9, ICP4 и UL47/Gg

С изключение на продуктите за амплификация ICP4, получени за щама USDA и ваксината TCO, всички реакции на амплификация водят до очаквания размер на PCR продукта (Таблица 2). Щамът USDA и ваксината TCO произвеждат два продукта за амплификация на ICP4, един с очаквания размер (4980 базови двойки [bp]) и по-голям фрагмент от приблизително 5800 bp (данните не са показани). Наличието на два амплификационни продукта може да отразява разликите в размера между двете генни копия на ICP4, налични в геномите на щамовете USDA и TCO. По-нататъшен анализ на последователността и на двата продукта за PCR на ICP4 ще докаже или опровергае това предположение.

RFLP модели за региона ICP4

Публикувано онлайн:

Фигура 1. Електрофореза в полиакриламиден гел на ДНК фрагменти, генерирани чрез рестрикционно ендонуклеазно смилане на ICP4 геномна област с ензим ХеIII (1а), HinP1I (1b), AlwI (1в) и АваI (1d). Буквите показват различни модели в сравнение с референтния щам на USDA. Допълнителните ленти са обозначени със стрелки, а липсващите ленти са обозначени със звезди в сравнение с еталонния щам. Модели B 0 и B се очакват от ICP4 на TCO-подобни щамове, усвоени от ХеIII, поради липса на стабилност на мястото, което генерира 500 bp фрагмента.

Фигура 1. Електрофореза в полиакриламиден гел на ДНК фрагменти, генерирани чрез рестрикционно ендонуклеазно смилане на ICP4 геномна област с ензим ХеIII (1а), HinP1I (1b), AlwI (1в) и АваI (1d). Буквите показват различни модели в сравнение с референтния щам на USDA. Допълнителните ленти са обозначени със стрелки, а липсващите ленти са обозначени със звезди в сравнение с еталонния щам. Модели B 0 и B се очакват от ICP4 на TCO-подобни щамове, усвоени от ХеIII, поради липса на стабилност на мястото, което генерира 500 bp фрагмента.

Публикувано онлайн:

Таблица 3. Сравнение на модели, генерирани от PCR-RFLP на избрани региони от различни ILTV изолати и щамове

RFLP модели за ORFB-TK и gM/UL9 региони

RE разграждане на ORFB-TK региона с BstUI ензимът произвежда идентични модели за всички тествани щамове и изолати в САЩ (данни не са показани); обаче храносмилането с BstF51 ензимът произвежда два различни модела (Фигура 2а и Таблица 3). Модел A се състои от фрагменти с размери приблизително 2422, 931, 513, 352, 232, 156 и 65 bp. Този модел беше характерен за щама USDA, ваксинните щамове (TCO и CEO) и всички търговски изолати от домашни птици. На модел B липсва фрагмент от 930 bp и има фрагмент от 400 bp. Моделът B е характерен за трите изолати от стадото в задния двор. RE разграждане на gM/UL9 областта с МвоI ензим генерира три различни модела (Фигура 2b и Таблица 3). Модел A се състои от фрагменти с размери приблизително 429, 312, 180, 107, 97, 86, 71, 61 и 48 bp. Този модел е характерен за щама USDA, TCO ваксината, 11 търговски изолати от домашни птици и три изолата от стадо в задния двор. На шаблон B липсват фрагментите от 71 и 61 bp и има фрагмент от 130 bp. Този модел е характерен за ваксините за изпълнителен директор и шест търговски изолати от домашни птици. В шаблон C липсва фрагмент от 86 bp и има фрагмент от 55 bp. Модел C е характерен за пет търговски изолати от домашни птици.

Публикувано онлайн:

Фигура 2. Електрофореза в полиакриламиден гел на ДНК фрагменти, генерирани чрез разграждане на рестрикционна ендонуклеаза. 2а: ORF B-TK, усвоен с ензим BstF5I; 2b: gM/UL9, усвоен с ензим MwoI; 2c: UL47/gG, усвоен с ензим AflII; 2d: UL47/gG, усвоен с ензим NlaIV; 2e: UL47/gG, усвоен с ензим FspI; 2f: UL47/gG, усвоен с ензим HaeIII; 2g: UL47/gG, усвоен с ензим MspI. Буквите показват различни модели в сравнение с референтния щам на USDA. Допълнителните ленти са обозначени със стрелки, а липсващите ленти са обозначени със звезди в сравнение с еталонния щам.

Фигура 2. Електрофореза в полиакриламиден гел на ДНК фрагменти, генерирани чрез разграждане на рестрикционна ендонуклеаза. 2а: ORF B-TK, усвоен с ензим BstF5I; 2b: gM/UL9, усвоен с ензим MwoI; 2c: UL47/gG, усвоен с ензим AflII; 2d: UL47/gG, усвоен с ензим NlaIV; 2e: UL47/gG, усвоен с ензим FspI; 2f: UL47/gG, усвоен с ензим HaeIII; 2g: UL47/gG, усвоен с ензим MspI. Буквите показват различни модели в сравнение с референтния щам на USDA. Допълнителните ленти са обозначени със стрелки, а липсващите ленти са обозначени със звезди в сравнение с еталонния щам.

RFLP модели за UL47/gG региона

Стабилност на PCR-RFLP

Стабилността на моделите PCR-RFLP беше оценена за пет CEO и шест TCO вируси, възстановени от птици 10 дни след ваксинацията. Моделите PCR-RFLP, получени за петте ваксинални вируса на CEO, възстановени от експериментално ваксинирани птици, са идентични с моделите, получени от ДНК, извлечена директно от флакона с ваксината (данните не са показани). За TCO ваксината 10 от 11 PCR-RFLP модела, генерирани за шестте вируса, възстановени от експериментално ваксинирани птици, са идентични с моделите, генерирани за TCO ваксиналния препарат. Въпреки това, PCR-RFLP модел за ICP4 региона, усвоен с ХеIII ензимът за приготвяне на ваксината TCO показва допълнителни 500 bp фрагмент (Фигура 1а, модел B 0). Този фрагмент от 500 bp не е открит при вируси, извлечени от птици 10 дни след ваксинацията с TCO ваксината. Този ICP4 /ХеIII модел е обозначен с B (Фигура 1а).

Множествен PCR-RFLP анализ

Анализът на комбинираните RFLP модели генерира общо девет групи (Таблица 3). Щамът USDA и TCO ваксината се различават само по един модел и са категоризирани като групи I и II. Два ILTV изолата от търговски животновъди са имали 10 идентични PCR-RFLP модела с търговските TCO ваксини RFLP модели и са категоризирани в група III. Шест ILTV изолати от домашни птици имат идентични PCR-RFLP модели с търговските ваксини на CEO, различават се по пет модела от щама USDA и по четири модела от ваксината TCO и са категоризирани като група IV. Девет ILTV изолати имаха 10 идентични модела на ваксини за изпълнителен директор. Тези изолати се различават само по един модел от ваксините на главния изпълнителен директор и споделят този модел с щама USDA и ваксината TCO и са идентифицирани като група V. Пет изолати от птици с търговска цел споделят два модела с щама USDA и ваксината TCO, пет модела с ваксините за изпълнителен директор, четири модела с един изолат от стадото в задния двор и имаше три уникални модела; тези изолати бяха категоризирани като VI група. Изолатите на стадото от задния двор се различават поне в седем модела в сравнение с щама USDA и ваксинните щамове (CEO и TCO) и са категоризирани отделно като групи VII, VIII и IX.

Клъстерни анализи на ILTV PCR-RFLP групи

Деветте групи, генерирани чрез комбиниране на RFLP модели, бяха разделени в три основни клъстера, както беше определено чрез анализ на клъстери и зареждане (Фигура 3). Първият клъстер е съставен от група I (референтен щам USDA), група II (ваксина TCO) и група III (два търговски изолата от домашни птици). Вторият клъстер е съставен от тясно свързани група IV (CEO ваксини и търговски птици изолати) и група V (търговски птици изолати). Трети клъстер беше съставен от група VI от търговски птици и групи VII, VIII и IX от стадо в задния двор. Буутстрапинг анализът показа, че изолатите от група VI от търговски домашни птици са по-тясно свързани с групи VII, VIII и IX от стадата в задния двор, отколкото с други търговски изолати от птици и щамове.

Публикувано онлайн:

Фигура 3. Дендограма, базирана на клъстерен анализ на PCR-RFLP комбинация от девет групи ILTV изолати и щамове. Коефициентите на сходство са изчислени по метода на Nei & Li (1978). Дължините на разклоненията представляват генетичното разстояние между групите, а числата на разклоненията са стойности на bootstrap като процент във вътрешните възли (500 преизборки). Група I, щам на ваксина USDA; Група II, TCO ваксинен щам; Група III, два търговски изолата от домашни птици; Група IV, ваксинални щамове и шест търговски изолати от домашни птици; Група V, девет изолати от домашни птици с търговска цел; Група VI, пет търговски изолати от домашни птици; Групи VII, VIII и IX, три изолати от стадо в задния двор.

Фигура 3. Дендограма, базирана на клъстерен анализ на PCR-RFLP комбинация от девет групи ILTV изолати и щамове. Коефициентите на сходство са изчислени по метода на Nei & Li (1978). Дължините на разклоненията представляват генетичното разстояние между групите, а числата на разклоненията са стойности на bootstrap като процент във вътрешните възли (500 преизборки). Група I, щам на ваксина USDA; Група II, TCO ваксинен щам; Група III, два търговски изолата от домашни птици; Група IV, ваксинални щамове и шест търговски изолати от домашни птици; Група V, девет изолати от домашни птици с търговска цел; Група VI, пет търговски изолати от домашни птици; Групи VII, VIII и IX, три изолата от стадо в задния двор.

Дискусия

Това проучване представя генетичната характеристика на изолатите на ILTV, събрани между 1988 и 2005 г. от различни региони на гъсто производство на птици в САЩ. Двадесет и два изолата бяха събрани от търговски домашни птици и три изолати от стада в задния двор. 11-те PCR-RFLP комбинации от модели, генерирани от смилането на четири геномни области с 10 RE, категоризират американските изолати в девет групи (Таблица 3). Изолатите на ILTV от търговски домашни птици бяха категоризирани в четири групи (III, IV, V и VI), а изолатите от стадото в задния двор бяха категоризирани в три отделни групи (групи VII, VIII и IX). Стабилността на 11 PCR-RFLP модела беше тествана за ваксиналните щамове след репликация при пилета. Показано е, че моделите PCR-RFLP за една CEO ваксина са стабилни след репликация на ваксинен щам при пилета. За ТСО ваксината 10 от 11 модела са показали, че са стабилни след репликация на ваксинен щам при пилета. Въпреки това ICP4 /ХеМоделът на смилане III на TCO ваксината (модел B 0, фигура 1а) се характеризира с допълнителни 500 bp фрагмент, който не е открит след репликация на ваксиналния щам TCO при пилета (модел B, фигура 1а), което показва, че това място не е стабилно и не може да се счита за маркер за идентифициране на свързани с ТСО щамове.

PCR-RFLP анализ на UL47/gG региона с ензими АфлII, Fspаз и НлаIV произвежда различни модели сред търговски изолати от домашни птици (група VI) и изолати от стада в задния двор (групи VII, VIII и IX). Конструирането на мутант на делеция на ILTV gG предостави доказателства, показващи, че gG може да допринесе за вирусната вирулентност (Devlin и др., 2006). Следователно, SNPs на gG гена сред американските изолати стават релевантни, тъй като те могат да повлияят на вирусна вирулентност. Генетичното разнообразие също беше открито в gM/UL9 региона, където SNP в gM, разпознат от МвоI ензимно отделени търговски изолати от домашни птици (група V) от ваксините на изпълнителния директор.

Въпреки че PCR-RFLP категориите, генерирани в това проучване, могат да бъдат модифицирани, когато се извършва по-интензивен анализ на секвенцията на тези изолати, този доклад идентифицира геномните области на генетично разнообразие сред американските ILTV изолати, представя първата цялостна генотипна характеристика на разнообразна група изолати от САЩ и осигурява рамката за по-нататъшен анализ на последователността. В допълнение към секвениращия анализ, бъдещата работа ще включва изследвания на патотипирането на представителни изолати от различните PCR-RFLP групи, идентифицирани в това проучване.