Изследователска работа

  • Пълен член
  • Цифри и данни
  • Препратки
  • Допълнителни
  • Цитати
  • Метрика
  • Лицензиране
  • Препечатки и разрешения
  • PDF
  • EPUB

РЕЗЮМЕ

Въведение

Резултати

Профили на фекална микробиота на кърмачета и техните майки

Както е показано на фигура 1а, профилите на микробиотата на фекалните деца са групирани отделно от тези на майките (стр Индонезийските фекални микробиоми от раждането до отбиването са различни от микробиомите на техните майки

статия

Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:

Таблица 1. Споделени OTU между пробите на майките и фекалните проби на децата (%).

Профил на вагиналната микробиота на майките

В нито една от възрастовите групи на бебетата профилите на фекална микробиота на деца не са близо до профилите на вагиналната микробиота на майката (Фигура 2а, б), въпреки че всички бебета са били вагинално доставени. Споделената микробиота на детските изпражнения през първия месец от живота и влагалището на майките е 9,2% (Таблица 1). Изобилието на Превотела във вагиналната микробиота е най-висока, когато децата са на възраст под 1 месец (Фигура 2b) и постепенно намалява след това. Лактобацилус е най-много в различните възрастови групи, с изключение на първия месец от живота. След 24-месечна възраст, Превотела съставляват около 10% от общите фекални OTU на повечето от децата (66,7% от децата).

Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:
Публикувано онлайн:

Фигура 4. Сравнение на концентрацията на цитокини във фекални водни проби на деца на възраст под 1 месец до 48 месеца. Данните са изразени като средна концентрация в pg/ml. Броят на пробите е предоставен в скоби по оста X. A = на възраст под 1 месец, B = 1– Фигура 4. Сравнение на концентрацията на цитокини във фекални водни проби на деца на възраст под 1 месец до 48 месеца. Данните са изразени като средна концентрация в pg/ml. Броят на пробите е предоставен в скоби по оста X. A = на възраст под 1 месец, B = 1 - индонезийският фекален микробиом от раждането до отбиването е различен от микробиомите на техните майки

Публикувано онлайн:

Фигура 5. Корелация на известни патогени (ос X) и известни видове коменсални черва (ос Y) на видово ниво на изобилие (a) преди и (b) след отбиване (6– Фигура 5. Корелация на известни патогени (X -ос) и известни видове коменсални черва (оста Y) на видово ниво на изобилие (а) преди и (б) след отбиване (6– индонезийски фекален микробиом на децата от раждането до отбиването е различен от микробиомите на техните майки

Публикувано онлайн:

Фигура 6. Сравнение на концентрацията на свободни жлъчни киселини - (а) първични жлъчни киселини (CDCA, СА) (б) вторични жлъчни киселини (DCA, LCA, UDCA) (в) 12 жлъчни киселини - във фекални водни проби на деца от възраст под 1 месец до 48 месеца. Представени са средната и стандартната грешка на средната стойност (SEM). Брой проби са описани в скоби по оста X. A = на възраст под 1 месец, B = 1– Фигура 6. Сравнение на концентрацията на свободни жлъчни киселини - (a) първични жлъчни киселини (CDCA, CA) (b) вторични жлъчни киселини (DCA, LCA, UDCA) (c) 12 жлъчни киселини - във фекални водни проби на деца на възраст под 1 месец до 48 месеца. Представени са средната и стандартната грешка на средната стойност (SEM). Брой проби са описани в скоби по оста X. A = на възраст под 1 месец, B = 1 - индонезийският фекален микробиом от раждането до отбиването е различен от микробиомите на техните майки

Публикувано онлайн:

Таблица 2. Корелация между изобилието на фекални бактериални родове (> 1% от общия брой OTU) и количеството на определени групи храни, които децата консумират на ден на възраст (а) 6–12 месеца, (б) 12–24 месеца и (в) 24– 48 месеца.

Публикувано онлайн:

Олигозахаридите от човешко мляко насърчават растежа и колонизацията на Bifidobacterium преди отбиването. 44 - 46 Освен това, кърмата има високо съдържание на мазнини, 47 които могат да предизвикат секреция на жлъчни киселини в стомашно-чревния тракт, инхибират Превотела и улесняват разпространението на Бактероиди и Bifidobacterium, както се съобщава в литературата. 48, 49 Високи нива на свободни първични жлъчни киселини бяха открити във фекалната вода на децата преди отбиването (Фигура 6). Промените в GI микробиома след отбиването доведоха до превръщането на първичните жлъчни киселини във вторични жлъчни киселини (Фигура 6), което се подкрепя от проучване на японски бебета. 50

Функцията на Бактероиди и Bifidobacterium преди отбиването и причината, поради която те са преобладаващи в ГИ на децата, изисква внимание. В случая с индонезийците, Бактероиди и Bifidobacterium са по-малко вероятно да допринесат за храносмилането на хранителни вещества в зряла възраст, както е показано в изместването на основната микробиота от Бактероиди и Bifidobacterium да се Превотела при отбиване (до 48 месеца) и ниско разпространение на Бактероиди и Bifidobacterium при майки (възрастни).

В това проучване се установи, че цитокините, които са отговорни за пролиферацията и узряването на имунните клетки и имунната система (IL-1β, -2, -5, -8, -12, TNF-α и IFN-β) нагорегулиран след отбиване (Фигура 4). Това предполага, че активният имунитет на децата се развива около периода на отбиване. В проучване на мишки, Bacteroides fragilis Установено е, че колонизацията потиска провъзпалителните TH17 клетъчни отговори. 51 Изобилието на Бактероиди установено преди отбиването в това проучване предполага възможна регулация на провъзпалителните клетки.

Превотела е най-много във вагиналните проби от майки, чиито деца са били на 16, 19 години Превотела няма роля в диетите с високо съдържание на мазнини/протеини в Европа и Северна Америка след отбиване. 8, 11 Вътрешните фактори за установяването на Превотела във влагалището на майките може да се закрепи въпреки промените в диетата в развитите страни през последните години. Ранната диета на човека е била до голяма степен базирана на зеленчуци, както диетата на индонезийците днес.

Предаването на микробиота от майката все още е идентифицирано като основен източник на GI микробиота на децата, тъй като цялата микробиота на децата може да бъде намерена при майките (фиг. 1–3). Въпреки това, големият брой OTU при майки, които не са били споделени с децата (Таблица 1) показва, че само малка част от микробиотата на GI, вагината и кърмата от майките са успели да установят в GI на своите деца на ранната възраст. Преобладаващата микробиота на майките няма предимство при колонизиране на стомашно-чревния тракт на децата. Едно от обясненията за колонизацията на GI на бебетата от недоминиращите щамове на майките може да бъде селективното предпочитание на специфични функционални гени на бебетата. 23, 52

ГИ микробиотата може да е била предавана не само вертикално, но и хоризонтално. 53 Независимо от това, както установяват това и други проучвания, процентите на споделените фекални OTU между майките и децата се увеличават с възрастта (Таблица 1). 22, 24 Фактът, че фекалните проби на по-големи деца споделят повече OTU с вагиналния тампон на техните майки в сравнение с тези на по-малките деца, може да отразява личните хигиенни практики сред индонезийските субекти (Таблица 1).

Bifidobacterium е бил отрицателно свързан със сложни въглехидрати, местни плодове и млечни продукти в различни възрастови групи. Това проучване (Таблица 2) подкрепя предишна констатация 10 за отрицателна асоциация на Bifidobacterium с наличие на устойчиво нишесте. Основният основен въглехидрат в Индонезия е оризът Индика, който е с високо съдържание на устойчиво нишесте. Неговото присъствие поради консумация на ориз след отбиване и персистиране в стомашно-чревния тракт водят до отстраняване на свободните жлъчни киселини от лумена, което може би е Превотела да се разпространява и намалява изобилието от Bifidobacterium, както е предложено в литературата. 10

Освен това, Превотела е въглехидратен ферментатор, 10, 11, който ще се размножава във високо въглехидратната диета на индонезийците. Освен това изглежда, че местните плодове и млечни продукти са инхибирали разпространението на Bifidobacterium в силно зависима от дозата материя (Таблица 2). Местните плодове могат да произведат антимикробни биомолекули за самосъхранение в среда с висока температура, която благоприятства микробната пролиферация. 55 - 57 В случая, Bifidobacterium може да бъде един от чувствителните микроби, което трябва да бъде допълнително проверено. Това може да обясни драстичното намаляване на изобилието на Bifidobacterium във фекалните проби на деца след отбиване и ниското му изобилие при майки (Фигура 1). В специални случаи, когато децата консумират повече бързи храни, смилаемите въглехидрати в храните на основата на пшеница, като кифлички, и в картофения чипс могат да доведат до положителната връзка между бързите храни и Bifidobacterium (Таблица 2). 10, 58

Функциите за укрепване на здравето на Bifidobacterium наблюдавано при европейски, северноамерикански и източноазиатски деца 29 - 32, 43, 54, при индонезийците може да са заменени от други коменсални бактерии, като напр. Enterococcus faecalis. 59, 60 На 24–48 месеца при децата може да се е развил узрял, балансиран микробиом, наподобяващ този на майките, поради сближаването на диетите им. Имунната система може да е наближила зреенето на 24–48 месеца, което води до понижаване на регулаторните цитокини, а именно IL-1β, −2, −5, −8, −12, TNF-α и IFN-γ (Фигура 4).

Заключения

Изследването предполага, че:

Установяването на преобладаващите бактерии при кърмачета е относително бързо (в рамките на един месец след раждането) и че то може да бъде инициирано само от малък брой засяващи бактерии от майките, като напр. Бактероиди и Bifidobacterium които са били части от малцинствената микробиота във всички проби на майката (изпражнения, кърма и вагина).

Преобладаващата микробиота при деца преди отбиване е свързана с вътрешни и външни фактори, като концентрация на жлъчка и цитокини, и евентуално млечни олигозахариди и муцин гликан (предложени в литературата, неизмервани в това проучване), които могат да благоприятстват Бактероиди и Bifidobacterium.

Бактероиди и Bifidobacterium са отрицателно свързани с потенциални патогени преди отбиването. Ролите им в защитата срещу инфекциозни заболявания трябва да бъдат проверени в клинични проучвания.

Диетичната промяна след отбиване променя фекалната микробиота на децата от Бактероиди и Bifidobacterium да се Превотела.

Взети заедно, данните предполагат, че профилите на микробиотата на децата са до голяма степен определени от средата на ГИ и хранителните компоненти, а не от майчинския трансфер. С други думи, някои вътрешни и външни фактори могат да определят предпочитаната микробиота, която колонизира стомашно-чревния тракт при деца. Това има важни последици за подходите за отстраняване на дисбиоза на ГИ микробиота.

Методи

Уча дизайн

Набиране на субекти

Триста здрави индонезийски майки и техните деца под 4-годишна възраст бяха наети от три здравни центъра в Йогакарта, Индонезия. Критериите за включване при набиране на субекти бяха, че децата са родени с нормално вагинално раждане, нямат анамнеза за хоспитализация за сериозни заболявания при раждане и са били кърмени изключително преди периода на отбиване (комплект 6- TM PicoGreen® (Invitrogen, САЩ). След количествено определяне, всяка ДНК проба се нормализира до приблизително 12,5 ng за полимеразна верижна реакция (PCR).

16 S rRNA ампликон производство и пречистване

KAPA HiFi TM PCR Kit (Kapa Biosystems, USA) беше използван в PCR за производството на 16 S rRNA ДНК ампликон. Реакционната смес за всяка ДНК проба включва 12,5 μl 2x KAPA HiFiHotStart Ready Mix, 0,5 μl всеки правен и обратен праймери и 11,5 μl от нормализираната ДНК проба. PCR се извършва в термоциклер, както следва: първоначална денатурация при 95 ° C за 3 минути, последвана от 25 цикъла на денатурация при 95 ° C за 30 секунди, отгряване при 55 ° C за 30 секунди, удължаване при 72 ° C за 30 секунди и последен цикъл на удължаване при 72 ° C за 5 минути. След PCR, продуктите се пречистват с помощта на перли Agencourt®AMPure®XP (Beckman Coulter, САЩ) и се суспендират отново в 50 μl 10 mMTris буфер (рН 8,5).

Добавяне на индекси и адаптери в индекс PCR и пречистване на продукти

Реакционната смес за всяка ДНК проба включва 12,5 μl 2x KAPA HiFiHotStart Ready Mix, 5 μl всеки от i7 и i5 праймери (Illumina, САЩ) и 5 ​​μl от ДНК ампликоните, получени в предишната PCR. PCR се извършва, както следва: първоначална денатурация при 95 ° С за 3 минути, последвана от осем цикъла на денатурация при 95 ° С за 30 секунди, отгряване при 55 ° С за 30 секунди, удължаване при 72 ° С за 30 секунди и окончателно удължаване при 72 ° С за 5 минути. Произведените библиотеки се пречистват отново с помощта на перли Agencourt®AMPure®XP и се суспендират отново в 25 μl 10 mM Tris буфер (рН 8,5).

Нормализиране на библиотеката, обединяване и повторно количествено определяне чрез количествена PCR (qPCR)

Библиотечната концентрация за всяка проба се измерва с комплекта Quant-it TM PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). След това всяка библиотека се нормализира до необходимата концентрация с 10 mM Tris буфер (рН 8.5) и 5 ​​μl от всяка нормализирана библиотека се обединява в епруветка. Получената обединена библиотека от ампликони (PAL) след това беше повторно количествено определена чрез qPCR, използвайки KAPA Kit Quantification Kit (Kapa Biosystems, USA), следвайки протокола на производителя.

Денатуриране и разреждане на библиотеката и PhiX Control

Анализ на данните за ДНК последователността

Количествени прозрения в микробната екология (QIIME) в анализ на данни от 16 S rRNA DNA ампликон

Получените данни за 16 S rRNA ДНК последователности бяха анализирани с QIIME версия 1.9.1. 61 В QIIME, съответните четения за обратно и напред бяха обединени и получените сдвоени четения бяха избрани въз основа на Q-резултат от 25. Химерните последователности бяха филтрирани и премахнати с помощта на USEARCH v6.1. 62 Получените последователности след това бяха подложени на OTU бране с отворен референтен код, използвайки Greengenes v13_8 като референтна база данни и праг на сходство от 97%. След това OTU бяха картографирани, използвайки обобщение на таксоните, за да се интерпретират допълнително бактериалните профили на пробите. Данните за бактериалния род бяха допълнително анализирани, за да се сравнят профилите на майките и децата. Изчислява се и средният процент на споделени OTU между пробите на майките и децата във възрастовата група на всяко дете. Използвайки софтуерния пакет Canoco5 (Microcomputer Power Co, Ithaca, USA), беше извършен анализ на основен компонент (PCA) върху квадратния корен от разстоянията на Bray-Curtis въз основа на относителното изобилие от данни за бактериален род.

Индекс на корелация

За количествено определяне на степента на корелация е използван индекс на корелация, включващ сумиране на стойностите на корелация (r) за коменсали и потенциални патогени. Индексът на корелация на нулева стойност не предполага нетна корелация между който и да е от коменсалите и патогените. Максималният положителен индекс на корелация е 168 (15 коменсали х 14 патогени х 0,8), докато най-високият отрицателен индекс на корелация е -84 (15 коменсали х 14 патогени х [-0,4]). Включените потенциални патогени бяха Neisseria, Pseudomonas, Bacteroides fragilis, Campylobacter ureolyticus, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella, Prevotella melaninogenica, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus, и Streptococcus anginosus. Включените видове коменсал бяха Akkermansia, Bifidobacterium, Blautia, Enterococci, Faecalibacteria, Lactobacilli, Ruminococci, Escherichia coli, други Бацили, други Бактероиди, други Campylobacter, други Клостридии, други Превотела, други Стафилококи, и други Стрептококи.

Приготвяне на фекална вода

Смес от 0,01 М фенилметилсулфонил флуорид (PMSF) (Sigma-Aldrich, САЩ) и 1% говежди серумен албумин (BSA) в разтвор на PBS беше прясно приготвена. Приблизително 1 g от прясно събраната фекална проба се смесва с удвоен обем на приготвения разтвор на PMSF-BSA-PBS чрез завихряне. След центрофугиране при 4000 g за 5 минути, супернатантата се прехвърля в нова епруветка и след това се центрофугира при 4000 g за 10 минути. Супернатантата се прехвърля в друга нова епруветка и се съхранява при -80 ° С за допълнителен анализ.

Анализ на фекалните водни цитокини

Използвайки LUNARIS TM Human 11-Plex цитокинов комплект (AYOXXA Biosystems, Австрия), нивата на IL-1β, IL-2, IL-4, Il-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL- 12 бяха измерени IFN-y, TNF-a и GM-CSF. Размразената и бистра супернатанта на фекална вода се разрежда в анализен разредител 1. Разредените стандарти, разредените проби и заготовките (повторения) първо се приготвят в микроплака с 384 ямки. Всички те бяха прехвърлени в LUNARIS TM BioChip и подготвени съгласно протокола на производителя. Флуоресцентните изображения бяха заснети с флуоресцентен микроскоп (Zeiss Axio Imager M2, Zeiss, Германия) и количественото определяне беше извършено с помощта на комплекта за анализ LUNARIS TM, включен в комплекта аксесоари LUNARIS TM (AYOXXA Biosystems, Австрия).

Анализ на жлъчните киселини

Анализ на въпросника за отбиване на храни

Хранителните продукти бяха категоризирани в десет групи: сложни въглехидрати, зеленчуци, бобови растения и соя, плодове, меса, млечни продукти, закуски, напитки, бързи храни и подправки (Текст S1). Записаните честоти и размери на сервиране на всеки хранителен продукт, консумиран от отбитите деца, се изчисляват като консумация на ден и допълнително се преобразуват в общото количество консумация в грамове на ден.

Статистически анализ

Всички статистически анализи и визуализация на данни бяха извършени с помощта на GraphPad Prism 8 (GraphPad Software Inc., САЩ) и R 3.5.2 софтуер (RStudio, Inc., САЩ). Беше извършен пермутационен дисперсионен мултивариантен анализ (PERMANOVA), използвайки двойния пакет Adonis R. 63 стр стойностите бяха коригирани чрез многократни сравнения на post-hoc Bonferroni. Двупосочният дисперсионен анализ (ANOVA) и тестът за многократно сравнение post hoc Bonferroni бяха извършени върху данните за относителното изобилие на бактериални родове, фекални водни цитокини и жлъчни киселини, за да се проверят значителните разлики в разпределението на бактериалните изобилия > 1% от общите OTUs), цитокини и жлъчни киселини в пробите между детските възрастови групи и между пробите на децата и майките. Тестът на Крускал-Уолис и тестът за множество сравнения post-hoc на Dunn бяха извършени, за да се проверят значителни разлики в отделните групи храни между деца от различни възрастови групи след отбиването. Непараметричният корелационен тест на Spearman също е използван за идентифициране на корелациите между OTU на известни видове чревни коменсали и потенциални патогени и между 1% от бактериалните родове и различните групи храни в тегло, използвайки микробиом R пакет 64 и GraphPad Prism 8.

Таблица 1. Споделени OTU между пробите на майките и фекалните проби на децата (%).