Резюме

Последните проучвания за асоцииране в целия геном при човешки популации идентифицират множество гени, свързани с често срещани полигенни заболявания, включително диабет тип 2 и затлъстяване (1). Въпреки това, поради техните вътрешни технически ограничения, тези проучвания могат да идентифицират само често срещани варианти с относително малък размер на ефекта и не редки варианти с голям размер на ефекта. За разлика от проучванията при хора, генетичните кръстоски в модели на полигенни животински животни позволяват картографиране на количествени локуси на признаци (QTL) и освен това конструкцията на вродени щамове, приютяващи специфичния хромозомен сегмент, може лесно да свърже свързаната с неравновесие връзка на връзката с физическата дефиниция на отговорен ген. Идентифицирането на генетични промени с основни ефекти при животинските полигенни заболявания ще задълбочи нашето разбиране за човешката патофизиология, както и откриването на причинно-следствените гени при моногенните заболявания на животните (2–4). Такива проучвания обаче изискват време и труд и малко от тях са показали реални генни промени.

подобна

Преди това идентифицирахме неинсулинозависим диабет 5 (Nidd5) върху мишка хромозома 2, който засяга затлъстяването чрез генетични кръстоски между мишки Tsumura, Suzuki, затлъстял диабет (TSOD) и контролира BALB/cA (BALB) мишки (5). След това генерирахме вродени щамове за този QTL и характеризирахме техните фенотипове, за да определим физически местоположението му (6). В настоящото проучване ние демонстрираме, че безсмислена мутация на гена Acvr1c, кодиращ активна рецепторна киназа 7 (ALK7), намалява затлъстяването. Дефицитът на ALK7 усилва регулирането на активирания от пероксизома пролифератор рецептор γ (PPARγ) и CCAAT/енхансер свързващ протеин (C/EBP) α и насърчава липолизата чрез увеличаване на експресията на мастните липази, което води до нетно намаляване на натрупването на мазнини. Изненадващо, PPARy и C/EBPα намаляват съдържанието на триглицериди (TG) в сума в зрелите адипоцити, въпреки че те насърчават както синтеза, така и разграждането на TG. Освен това, дефицитът на ALK7 при затлъстяване подобрява in vivo индуцираната от затлъстяването непоносимост към глюкоза и инсулинова резистентност. Тези открития предполагат, че PPARγ и C/EBPα играят липидиращи роли в зрелите адипоцити и сочат към ALK7-сигналния път като възможна цел за лечение на затлъстяването.

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Процедури с животни.

Всички експерименти с животни бяха извършени в съответствие с правилата и разпоредбите на Комитета за грижи и експерименти с животните към Университета Gunma. Мишките имаха свободен достъп до вода и стандартна лабораторна чау (CE-2; CLEA Япония) в климатизирана стая с 12-часови цикли на светлина/тъмнина. Съставът на диетата с високо съдържание на мазнини (HFD) е 55% мазнини, 28% въглехидрати и 17% протеини (калориен процент; ориенталска мая). Мишката TSOD първоначално е създадена като инбреден щам със затлъстяване и глюкоза в урината (7). Мишките BALB и C57BL/6N са закупени от CLEA Japan. Развитието на вродени щамове на мишки за Nidd5 е описано другаде (6). Генотипизирането се извършва с използване на праймери, изброени в допълнителна таблица 1. Само мъжки мишки са фенотипно характеризирани в това проучване. Взети са кръвни проби от опашната вена. Серумните нива на нестерифицирана мастна киселина (NEFA) и глицерол са измерени съответно чрез NEFA C-тест (Wako) и Free Glycerol Assay Kit (BioVision). Консумацията на кислород и производството на CO2 бяха измерени с помощта на системата Oxymax (Columbus Instruments).

Изолация на адипоцитите.

Епидидималната мазнина се изрязва, смила се и се усвоява с 1 mg/ml колагеназа тип I (Invitrogen) в продължение на 30 минути при 37 ° C при разклащане. Клетките се филтрират през 250 μm найлонова мрежа и се центрофугират при 50 х g за 10 минути. Плаващите адипоцити се промиват с PBS два пъти. Гранулата, съдържаща строма-съдова фракция (SVF), се филтрира през 40-милиметрова найлонова мрежа и се инкубира с лизиращ еритроцитите буфер (155 mmol/L NH4Cl, 5.7 mmol/L K2HPO4 и 0.1 mmol/L EDTA) при стайна температура за 5 минути и се промива с PBS два пъти. За имуноблотинг и имунопреципитация клетките се лизират с буфер (20 mmol/L HEPES (pH 7.4), 150 mmol/L NaCl, 1% Triton X-100, 0.2 mmol/L EDTA и 1 mmol/L дитиотреитол), съдържащи протеаза и фосфатазни инхибитори. За липидните метаболитни анализи се използва равен брой прясно изолирани адипоцити от всеки щам на мишка.

Клетъчна култура.

Клетъчна линия 3T3-L1, стабилно експресираща коксаки-аденовирусен рецептор (CAR) за улесняване на усвояването на аденовирус (8), се култивира в 10% телешки серум, съдържащ модифицирана среда на Dulbecco на Eagle. За да се индуцира диференциация в зрели адипоцити, сливните клетки (ден 0) бяха превключени към среда, съдържаща 10% FBS, допълнена с 5 μg/ml инсулин, 0,5 mmol/L 3-изобутил-1-метилксантин и 0,25 μmol/L дексаметазон за 2 дни и впоследствие с 5 μg/ml инсулин за 2 дни.

Количествени PCR анализи.

Общата РНК се транскрибира обратно, като се използва олиго- (dT) 12-18 праймер и Superscript III (Invitrogen). След това се извършва PCR със SYBR премикс Ex Taq (Takara Bio). Резултатите се нормализират спрямо експресията на рибозомния протеин 36В4 иРНК. Последователностите на грундовете са изброени в допълнителна таблица 2.

Векторна конструкция.

CDNAs с пълна дължина за ALK7, Smads, PPARγ2 и C/EBPα бяха транскрибирани обратно от РНК на миши епидидимални или 3T3-L1 адипоцити и субклонирани във pcDNA3 вектор (Invitrogen), модифициран да съдържа COOH-краен хемаглутининов маркер или COOH-терминал три тандемни FLAG етикета. Всички мутанти са генерирани с помощта на PCR-базирана стратегия за мутагенеза. РНК с къса коса (shRNAs) са проектирани според BLOCK-iT Adenovirus RNAi Expression System (Invitrogen). Последователностите на грундовете са изброени в допълнителна таблица 3.

Липидни анализи.

Включването на [14 С] палмитат в TG се измерва, както е описано по-горе (9). Накратко, изолирани адипоцити бяха инкубирани при 37 ° С в продължение на 2 часа в Krebs-Ringer-HEPES буфер, съдържащ 1% BSA без мастни киселини (FA) и 0,2 μCi/mL [1- 14 C] палмитинова киселина (PerkinElmer). Липолизата се оценява чрез измерване на концентрацията на глицерол. Адипоцитите бяха инкубирани при 37 ° С в продължение на 3 часа в буфер на Krebs-Ringer-HEPES, съдържащ 2 mmol/L глюкоза и 1% BSA без FA с или без 10 μmol/L изопротеренол (Sigma-Aldrich). Концентрацията на TG в клетъчните лизати се измерва с помощта на комплект за количествено определяне на TG (BioVision) и се нормализира за концентрацията на протеин. Чернодробното съдържание на TG беше измерено, както е описано по-горе (10).

Анализ на репортер на луцифераза.

Адипоцитите на CAR – 3T3-L1 (ден 6) бяха трансфектирани с репортер плазмид, съдържащ посочения ген промотор и контролен плазмид pGL4.74 [hRluc/TK] (Promega). На 5 часа след трансфекцията клетките бяха заразени с аденовирус и инкубирани за още 43 часа. Активността на луциферазата се измерва чрез система за анализ на двойна луцифераза (Promega). Последователностите на грунда са изброени в допълнителна таблица 4.

Анализ на имунопреципитация на хроматин.

Това беше извършено с помощта на ChIP комплект за анализ (Millipore). Утаените и входните ДНК се анализират за количествена PCR, като се използват праймерите, изброени в допълнителна таблица 5.

Анализ на секрецията на инсулин.

Десет пресни островчета, изолирани, както е описано по-горе (11), първо се инкубират при 37 ° С за 30 минути в буфер на Krebs-Ringer-HEPES, съдържащ 0,1% BSA и 2,8 mmol/L глюкоза и след това за още 30 минути в същия буфер, съдържащ 16,7 mmol/L глюкоза. Инсулинът, секретиран във всеки буфер или останал в клетките, се измерва с помощта на инсулинов комплект AlphaLISA с EnVision 2101 четец за много маркировки (PerkinElmer).

Антитела.

Заешко поликлонално антитяло се генерира към СООН-терминалната област (230–493 аминокиселини) на ALK7 протеин и се афинитетно пречиства от цял ​​серум, използвайки антигенния протеин, имобилизиран върху нитроцелулозна лента. Други налични в търговската мрежа антитела са изброени в допълнителна таблица 6.

статистически анализи.

Статистическата значимост се определя с помощта на двустранен тест на Student t или еднопосочен ANOVA с тест за множество сравнения на Tukey.