Кристиан Паскуали

1 OM Pharma SA Женева, Женева, Швейцария

лигавични

Олавала Салами

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Маниша Танеха

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Ева С. Голвицър

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Аурелиен Тромпет

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Селин Патарони

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Кошика Ядава

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Жак Бауер

1 OM Pharma SA Женева, Женева, Швейцария

Бенджамин Дж. Марсланд

2 Биологически и медицински факултет, Университет в Лозана, Service de Pneumologie, CHUV, Лозана, Швейцария

Резюме

Въведение

Повтарящите се инфекции на дихателните пътища (RTI) са водеща причина за заболеваемост и смъртност, като терапевтичните възможности до голяма степен се ограничават до традиционните антибиотични лечения (1). Причината за податливост към РТИ е различна, но като цяло отразява неспособността на имунната система да предотврати продуктивни инфекции (2). По този начин режимите на лечение, които повишават ефективността на имунната система, са валиден и рационален подход.

Имунната система е незряла при раждането и след микробна колонизация и взаимодействия гостоприемник-микроб, тя узрява и развива способността за ефективен контрол на инфекциите (3). Проучвания, използващи аксенови (без микроби) мишки, които не съдържат микроби, показват, че при липса на микробна колонизация има лимфопения, драстично намалени нива на лигавицата IgA и нарушена целостта на епителната бариера (4). Последните изследвания подчертават значението на взаимодействията между гостоприемника и микробите както за здравето, така и за заболяванията и тези данни подкрепят концепцията за модулиране на микробиотата на гостоприемника чрез използване на пребиотици или пробиотици за профилактика на заболяванията (5). Алтернативен подход е директното приложение на пречистени микробни компоненти или бактериални екстракти, които осигуряват сигнали за узряване на имунната система (6–9). В действителност, както клиничните, така и експерименталните проучвания показват, че прилагането на бактериални екстракти може да бъде ефективно при многобройни заболявания, като хронична обструктивна белодробна болест, повтарящи се инфекции на дихателните и пикочните пътища с бактериален или вирусен произход, хриптене на долните дихателни заболявания (WLRI) и последващи астма (10, 11).

Експерименталните проучвания подкрепят концепцията, че излагането на бактериални компоненти може да повлияе на отговора на различни патогени. Мишките, предварително обработени с аерозолен лизат на Haemophilus influenzae, са защитени срещу респираторна инфекция с различни патогенни бактерии и гъби, включително Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus anthracis и Aspergillus fumigatus (12). Същото лечение също така защити мишките срещу пулверизирания грипен вирус (13). През 90-те години и по-скоро клиничните проучвания показват, че лечението с бактериален екстракт, OM-85 (предлаган на пазара като Broncho-Vaxom, Broncho-Munal, Ommunal, Paxoral, Vaxoral), е ефективно срещу различни RTI (14-17). Ефикасността при намаляване на заболеваемостта също е показана с OM-85 при деца, засегнати от повтарящи се RTI (18) и значително намалява скоростта и продължителността на вирусно-индуцирания WLRI при деца в предучилищна възраст с остър RTI (19). Както при общото влияние на микробната колонизация, имуностимулиращите пътища, предизвикани от бактериалните екстракти, са различни. Последните данни показват, че TLR4 и TLR2 могат да бъдат стимулирани от OM-85 (20) и се съобщава за влияние върху разширяването на Т регулаторните клетки и подобряване на отговорите на Т хелпер тип 1 (21).

Материали и методи

Мишки и инфекции

Количествено определяне на бактериалното натоварване в кръвта

Двадесет и четири часа след заразяването се взема проба от кръв и се разрежда серийно, последвано от нанасяне върху LB (Klebsiella) или Mueller Hinton + 5% плочи от агари с овча кръв (Streptococcus) и инкубиране за една нощ при 37 ° C. След 24 часа инкубация се преброяват бактериални колонии и екстраполират CFU.

Точкуване на болести

Като цяло 1 точка за здрава мишка; 2 точки за мишка, показваща признаци на неразположение, включително лека пилорекция, леко променена походка и увеличена амбулация; 3 точки за мишка, показваща признаци на силна пилоерекция, свит корем, променена походка и периоди на бездействие; 4 точки за мишка с подобрени характеристики на предишната група, но показваща малка активност и отпадаща; и 5 точки за мъртва мишка.

Антитела и поточна цитометрия

За поточна цитометрия бяха използвани различни комбинации от следните антитела. За анализ на подмножества на дендритни клетки (DC) в белия дроб, комбинация от CD11b PerCP-Cy5.5, CD11c APC-Cy7, B220 FITC, MHC II Alexa Fluor 700, CD40 PE, ICOS-L PE, CD80 PE или CD86 Използвано е PE. Анализът на В-клетъчните подмножества беше извършен с CD19 PE, CD23 PE-Cy7, CD21 Pacific Blue, IgD FITC и IgM APC. Специфичните за грипа CD8 + Т-клетки бяха оцветени с NP-тетрамер 366–374. Всички антитела са закупени от Biolegend (Сан Диего), освен ако не е посочено. Оцветените клетки бяха получени на BD FACS CANTO или LSRII и анализирани със софтуера FlowJo (Tree Star, Inc.).

Количествена PCR в реално време

Общата РНК се пречиства от клетки, получени от цели бели дробове и трахея на мишки, като се използва три реагент (Sigma Aldrich). PCR в реално време се извършва в съответствие с инструкциите на производителя, като се използва квантовият SYBR зелен RT-PCR комплект (Qiagen). Използвани са следните праймери: бета-актин напред 5′-CCCTGAAGTACCCCATTGAAC-3 ′ и обратен 5′-CTTTTCACGGTTGGCCTTAG-3 ′; грипен матричен протеин напред 5′-GGA CTG CAG CGT AGA CGC TT-3 ′, обратен 5′-CAT CCT GTT GTA TAT GAG GCC CAT-3 ′. Данните са представени като съотношение на стойностите на Cq от гена на грипния матричен протеин към домашния ген, бета-актин.

Анализ на клетки от бронхоалвеоларния лаваж и белите дробове

BAL се извършва чрез промиване на дихателните пътища два пъти с 500 μl PBS/0,1% BSA. Общият брой на клетките се определя с помощта на брояч на Beckmann Coulter. Клетки от BAL се въртяха върху стъклени стъкла с помощта на Cytospin 3 (Shandon). След това предметните стъкла се оцветяват с помощта на Diff Quick оцветяващ комплект (Dade Behring, Siemens Healthcare Diagnostics, Deerfield, IL, USA) и диференциалният брой клетки се определя микроскопски. Процентите на макрофагите, неутрофилите, еозинофилите и лимфоцитите бяха определени в обща популация от 200 клетки.

За изолиране на клетки от белия дроб, белите дробове се перфузират с PBS и след това се усвояват в среда, допълнена с 2 mg/ml колагеназа IV (Invitrogen-Gibco). Едноклетъчна суспензия се получава чрез разбиване на усвоените бели дробове през 70 μM клетъчно цедка (Milian Falcon).

In vitro активиране на спленоцити

Далаците бяха изолирани от мишки BALB/c и обединени. Тъканите се поставят в IMDM среда, съдържаща колагеназа, нарязват се на приблизително 2 mm кубчета и се инкубират в продължение на 45 минути при 37 ° C с леко разклащане. След инкубацията, останалата тъкан и среда се пресова през 70 μm клетъчни цеди и се промива с PBS, съдържащ 0,2% BSA. Червените кръвни клетки бяха лизирани и клетките бяха преброени с помощта на брояч на Coulter (IG Instruments, Цюрих, Швейцария). Култури с 1 × 106 клетки на гнездо в 48 ямкови плаки (Nunc) с обем от 500 μl среда бяха поставени в три екземпляра. Клетките бяха стимулирани с OM-85 при концентрации 1 mg/ml, 100 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml или 0 μg/ml.

Статистически анализ

За изчисляване на нивата на значимост между лечебните групи, както е посочено, е използван t-тест на Student (несдвоен, двустранен) или еднопосочен ANOVA. Генерирането на графики и статистическият анализ бяха извършени с помощта на софтуер Prism версия 5 (GraphPad, La Jolla, CA, USA). Използвано е стандартно отклонение (SD).

Резултати

Бактериалният екстракт, OM-85, предизвиква засилен вроден отговор, който контролира грипната вирусна инфекция