Кейли Робъртс Лий

Отдел по ендокринология и диабет, Детска болница във Филаделфия, Филаделфия, Пенсилвания

получените

Ясмин Миджет

Отдел по ендокринология и диабет, Детска болница във Филаделфия, Филаделфия, Пенсилвания

Рачана Шах

Отдел по ендокринология и диабет, Детска болница във Филаделфия, Филаделфия, Пенсилвания

Резюме

Контекст

NRLP3 инфламазома е мултипротеинов комплекс за чувствителност на опасността, който служи като критична връзка между свързаното със затлъстяването мастно възпаление и инсулиновата резистентност и е доказано при животински модели, че се инхибира от дълговерижни омега-3 полиненаситени мастни киселини, получени от рибено масло -3 PUFA).

Обективен

Проведохме клинично изпитване и експерименти in vitro, за да тестваме нашата хипотеза, че n-3 PUFA потискат NLRP3 инфламазома при затлъстяване при хора чрез понижаване на експресията на ген на инфламазома в адипоцити и макрофаги.

Дизайн

Плацебо-контролирано клинично изпитване и експерименти в култура in vitro с първични човешки адипоцити (от биопсични проби) и човешки THP-1 моноцитни макрофаги, третирани с ейкозапентаенова киселина (EPA) и/или докозахексаенова киселина (DHA) спрямо контрола на носителя.

Настройка

Обща общност, изследователска лаборатория.

Пациенти и други участници

Затлъстяване (индекс на телесна маса ≥ 30 kg/m 2), недиабетни мъже и жени на възраст от 18 до 50. N = 25.

Интервенции

Клинично изпитване: Осемседмично лечение с 4 g Lovaza (EPA и DHA) или плацебо. Култивиране на клетки: EPA и/или DHA при 100 µg/mL или контрол на носител в хранителна среда.

Основни изходни мерки

Експресия на мРНК на мастна тъкан или адипоцити/макрофаги на IL-1β и IL-18 и циркулиращи нива на IL-18.

Резултати

Лечението на затлъстели хора с добавки с рибено масло намалява експресията на мастни възпалителни гени, включително свързани с възпаление IL-18 и IL-1β и нива на циркулиращ IL-18. Както EPA, така и DHA намаляват експресията на възпалителен ген при затлъстели човешки мастни и човешки адипоцити и макрофаги.

Заключения

N-3 PUFA намалява възпалението на NLRP3 в човешката мастна тъкан чрез регулиране на генната експресия в адипоцити и моноцити/макрофаги и има потенциал като хранителен терапевтичен агент за предотвратяване на възпаление, свързано със затлъстяването.

Затлъстяването е добре познато като нискостепенно възпалително състояние; възпалението в метаболитно активните тъкани, включително мастната тъкан, може да допринесе за метаболитна дисфункция, свързана със затлъстяването, и кардиометаболитно заболяване. Фактори, включително разширяване на депото на мастната тъкан и излишък на свободни мастни киселини, водят до активиране на възпалителни пътища, които набират провъзпалителни макрофаги в мастната тъкан. Заедно адипоцитите и активираните макрофаги си взаимодействат, за да увеличат секрецията на възпалителни цитокини (включително TNFα и IL-1β), които директно и индиректно действат върху инсулиновите сигнални пътища за насърчаване на инсулиновата резистентност [1–13].

IL-1β води до инсулинова резистентност чрез активиране на NF-κB и JNK сигнализиране [21], което насърчава сериновото фосфорилиране на IRS1, насочвайки го от разрушаване вместо тирозин-фосфорилирането, необходимо за сигнализиране на инсулина [22]. Въпреки че е по-малко ясно как IL-18 влияе върху инсулиновата сигнализация, проучване при хора показва, че макрофагите от субекти с диабет тип 2 имат по-висока секреция на IL-18 от здравите контроли и че лечението с инсулин-сенсибилизиращия агент метформин намалява секрецията на IL-18 [23].

Установено е, че експресията на компонентите на NRLP3 се увеличава в мастната тъкан на затлъстели хора и мишки [24, 25], а загубата на тегло при хора води до намалена експресия в бялата мастна тъкан [25]. Няколко животински модела демонстрираха, че липсата на компоненти на възпаление е свързана със защита от свързаната със затлъстяването инсулинова резистентност [25–27]; въпреки че има несъответствие в този отговор, тъй като друга група е показала, че свързаното със затлъстяването възпаление не е свързано с повишено разцепване на каспаза-1 и нулевите мишки Nlrp3 не са защитени от възпаление на мастната тъкан [28]. Придавайки допълнителна вяра на вероятната роля на NRLP3 в затлъстяването и метаболитната дисрегулация, проучвания за асоцииране с геном (досега докладвани при китайски популации Han) показват връзка на полиморфизъм на единичен нуклеотиден NLRP3 със затлъстяване [29] и с диабет тип 2 и инсулинова резистентност [30, 31].

Няколко проучвания, използващи животински и in vitro модели, демонстрират, че наситените мастни киселини са мощни активатори на NLRP3 инфламазома [15, 16, 32–34]. За разлика от тях, ненаситените мастни киселини, особено полуновените от омега-3 полиненаситени мастни киселини (n-3 PUFA), получени от рибено масло, могат да инхибират възпалението [35]. Общ противовъзпалителен ефект на рибеното масло при индуцирано от затлъстяване мастно възпаление е показано многократно при животински и човешки модели [36–39]. В адипоцитите на 3T3-L1 кокултурата с макрофаги от мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) с рибено масло, има намалена експресия на IL-1β, IL-18 и каспаза-1, както и намалена активност на каспаза-1 в сравнение с HFD без рибено масло [35]. Към днешна дата няма публикувани проучвания за въздействието на n-3 PUFA върху инфламазома в модели на човешка или човешка клетъчна култура.

Проведохме клинично изпитване на добавки с n-3 PUFA върху мастна тъкан NLRP3 възпалителна активност при затлъстяване, както и експерименти с ex vivo мазнини и кокултура с първични човешки адипоцити и макрофаги, получени от THP-1 моноцити, за да демонстрираме ефектите на n-3 PUFA върху възпалителният NLRP3.

1. Материали и методи

А. Клинично изпитване

Всички описани клинични проучвания са извършени с одобрението на Институционалния съвет за преглед на Университета в Пенсилвания (UPenn), след като е получено писмено информирано съгласие от всички участници в изследването и е регистрирано на клиничен триал.гов (> NCT02010359). Набрахме здрави затлъстели лица на възраст от 18 до 50 години с индекс на телесна маса ≥30 mg/m 2 от общата общност за проучването за намаляване на рибните масла и мастното възпаление. Общо 25 субекта (13 Lovaza, 12 плацебо) са завършили проучването и са включени в тези анализи.

Изключенията включват диагностика на диабет (глюкоза на гладно> 126 mg/dL, или произволна> 200 mg/dL, или използване на какъвто и да е антидиабетно средство), използване на някакви понижаващи липидите лекарства, възпалително заболяване или използване на противовъзпалителни средства (включително над противоаналгетиците и инхалаторни/локални/назални стероиди), обичайно приемане на риба>> три порции/месец и/или нежелание да се елиминира целия прием на риба по време на проучването, прием на добавки с рибено масло в рамките на 6 месеца, условия, които биха противопоказали употребата на Lovaza (чернодробна дисфункция, анемия, аритмия, коагулопатия), бременност и кърмене.

Участниците, които отговарят на първоначалните критерии по телефона/интервю по електронна поща, преминаха скринингово посещение с медицинска история, физически прегледи, електрокардиограма, тест за бременност в урината при жени и лаборатории за глюкоза на гладно, пълна кръвна картина, панел на чернодробната функция и липиди. Ако отговарят на условията, те се връщат на рандомизирано посещение, което включва вземане на кръв на гладно и глутеална мастна биопсия, както се съобщава по-рано [40, 41]. Накратко, подкожните мастни проби бяха събрани чрез аспирация на сърцевинна игла през 4-мм глутеален разрез. Субектите са получили идентификатор на субекта и са били рандомизирани на Lovaza 4 g/d или плацебо по двойно-сляп начин (управлявано чрез UPenn Investigational Drug Service). Субектите, върнати за посещение за завършване на проучването, планирано след 8 до 10 седмици на изследваното лекарство, което отново включва вземане на кръв на гладно и мастна биопсия от контралатерален глутеален сайт. Пробите от мастна тъкан и кръв се разпределят аликвотно и се съхраняват при -80 ° C до по-нататъшен анализ.

Б. Измерване на циркулиращи метаболити и възпалителни маркери

Измерванията на инсулин и липиди на гладно се извършват от Translational Core Laboratory на Университета в Пенсилвания, използвайки Roche Cobas c311 (Roche, Базел, Швейцария). HOMA-IR се изчислява, като се използва следната формула: ниво на инсулин на гладно (µIU/mL) × ниво на глюкоза на гладно (в mM) /22.5. Възпалителни маркери [IL-6, моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1), IL-18 и IL-1β] и адипонектин с високо молекулно тегло (HMW) са количествено определени чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ, изпълнен в два екземпляра според указанията на производителя (R&D Systems, Минеаполис, Минесота) [42–45] и прочетете на спектрофотометър Epoch Microplate (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT). Дисперсионните коефициенти са 2. Клетките бяха отгледани до 80% сливане, преди да бъдат диференцирани, както беше описано по-рано [41].

Д. THP1 Диференциация и поляризация на макрофагите

THP1 моноцитите, закупени в търговската мрежа (Sigma-Aldrich Corp.), се поддържат в култура при 1 × 106 клетки/ml в среда за култивиране THP1 [среда RPMI, допълнена с 1 -глутамин (2 тМ), HEPES (10 тМ), натриев пируват (1 mM), d -глюкоза (625 mg/L), бетамеркаптаетанол (100 uL/​​L) и 10% фетален говежди серум]. Диференциацията беше постигната чрез посяване на 3 х 10 3 клетки/cm 2 в THP1 културална среда с 200 цМ форбол 12-миристат 13-ацетат (РМА) за 72 часа. На този етап РМА се отстранява и клетките се култивират в среда без РМА THP1 културална среда в продължение на 5 дни, преди да се поляризират. Предварителните експерименти с времеви курс и реакция на дозата определят тези условия на култивиране за получаване на неутрални, неполяризирани (M0) макрофаги (данните не са показани). След това М0 макрофагите бяха поляризирани до М1 класически активирани, провоспалителни макрофаги чрез култивиране на клетките в културална среда THP1 с липополизахарид (100 ng/mL) и INF-γ (20 ng/mL) за 24 часа.

Е. Първични експерименти за съвместна култура на адипоцити/макрофаги

Първичните адипоцити се култивират с класически активирани THP1 макрофаги, използвайки системата за кокултура Costar Transwell (Corning Life Sciences, Corning, NY). Преди кокултурата първичните адипоцити се поставят в долното отделение на 12-ямкова плоча при 1 × 106 клетки/ml и се диференцират. В отделна 12-ямкова плака, без никакви клетки в долното отделение, 1 × 10 5 THP1 клетки се посяват, диференцират и поляризират в горното отделение на вдлъбнатината на транс. След като както първичните адипоцити, така и THP1 макрофагите бяха диференцирани и поляризирани, вложките на транс кладенци, съдържащи класически активирани макрофаги, бяха поставени вътре в долното отделение, съдържащо адипоцити.

Първичните адипоцитни и THP1 макрофагични култури се третират с LC n-3 PUFA EPA и DHA, получени от рибено масло, разтворени в DMSO. И двата клетъчни типа се третират със 100 цМ EPA, 100 цМ DHA, комбинация от 50 цМ EPA и 50 цМ DHA или носител (DMSO) в продължение на 48 часа. Времето и концентрацията на лечението се определят въз основа на предварителния отговор на дозата и експериментите с хода на времето (данните не са показани).

G. Екстракция на РНК, синтез на cDNA и количествена PCR

Цялата мастна тъкан се хомогенизира или за in vitro експерименти адипоцитите и моноцитите се измиват и лизират за изолиране на РНК, като се използва реагент TRIzol (Life Technologies, Foster City, CA). Концентрацията и качеството на РНК се определят с спектрофотометър Epoch Microplate (BioTek Instruments, Inc.) и се приготвя cDNA, като се използва комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Life Technologies). Експресията на гени се определя чрез количествена PCR в реално време, използвайки TaqMan Universal PCR MasterMix и праймери и сонди от Life Technologies и количествената PCR система QuantStudio6. Нивата на генна експресия се нормализират към домакинския ген GAPDH и относителната експресия се определя с помощта на метода 2- ΔΔCt [46].

З. Статистически анализ

Статистическият анализ беше направен с помощта на софтуера GraphPad Prism 6. Статистическата значимост на разликата между контролните и култивираните клетки се определя чрез тест на Student или U-тест на Mann-Whitney в зависимост от това дали може да се приеме нормалност. При измерване на статистическата разлика между третирани с EPA и DHA клетки се използва еднопосочен ANOVA. Двупосочен ANOVA беше използван за определяне на статистическата значимост между генната експресия във висцерална и подкожна тъкан при експерименти ex vivo.

2. Резултати

А. Добавки с рибено масло Намалена експресия на мастна тъкан на възпалителни гени NLRP3 и циркулиращ IL-18 при човешко затлъстяване

Данните се представят като средно (SD) за непрекъснати променливи или като процент за категорични променливи.

Съкращения: HDL, липопротеин с висока плътност; LDL, липопротеин с ниска плътност.