Субекти

Резюме

Въведение

През последните няколко десетилетия основната цел на птицепроизводството в много страни е да се увеличи темпът на растеж на животните. Съвременните щамове бройлери обаче често са склонни да имат прекомерен депозит на мазнини в корема 1,2, което трябва да се контролира, тъй като има отрицателно въздействие върху производството на птици, както се вижда от увеличаването на разходите за фураж по време на отглеждането, намаляването на крайното качество на месо, и значителната икономическа загуба за птицефабрики 3,4,5. Поради икономическите опасения и отвращението на потребителите към отлагането на излишни мазнини, контролът върху излишните мазнини и подобряването на качеството на месото са важни теми за изследване на учените по птицевъдството.

(-) - Хидроксилимонена киселина [(-) - HCA], която е основната активна съставка в плодовите кори на Гарциния камбоджа 6,7, е известно, че насърчава загуба на тегло 8,9,10, увеличава скоростта на синтез на гликоген 11, потиска de novo синтез на мастни киселини 12,13 и увеличаване на окисляването на липидите 14,15,16. Наскоро нашата лаборатория също установи това Гарциния камбоджа екстрактите могат да отслабят натрупването на мазнини чрез регулиране на експресията на гена за липолиза чрез сигналния път на адипонектин-AMPK в модел на затлъстяване при плъхове, предизвикан от диета с високо съдържание на мазнини 17. Освен това, предишни проучвания показват, че при животни и хора, (-) - HCA е мощен инхибитор на ATP-цитрат лиаза 18,19, който катализира разцепването на цитрат до оксалоацетат и ацетил-CoA и евентуално ограничава наличността на ацетил -CoA единици, необходими за синтеза на мастни киселини и липогенезата 10,20. Основният биохимичен механизъм обаче не е добре разбран, особено ефектите на (-) - HCA при пилета-бройлери.

Липидният метаболизъм при домашните птици се различава от този при бозайниците, като черният дроб е основният орган, участващ в метаболитната активност при домашните птици 21,22. При домашните птици катаболизмът на мастните киселини (β-окисление) настъпва предимно в митохондриите, докато мастните киселини се синтезират в цитоплазмата на хепатоцитите 22. Подходът на протеомиката е мощен инструмент за изучаване на биологични механизми 23,24. Освен това, глобален анализ на експресията на протеини на черния дроб би помогнал за идентифицирането на диференциално експресирани протеини, участващи в метаболизма на липидите, и ще даде нова представа за механизма на отлагане на мазнини при пилета-бройлери.

Хранителни добавки от Гарциния камбоджа екстракти, потенциална терапия за намаляване на отлагането на мазнини, може да бъде практичен начин за намаляване на прекомерната трупна мазнина при домашните птици. Настоящото проучване е предназначено да изследва ефекта от добавянето на (-) - HCA върху чернодробната експресия (митохондриална и цитоплазматична) на свързани с липидния метаболизъм протеини/ензими при пилета-бройлери. Целта беше да се идентифицират различните протеини, които участват в липидния метаболизъм и да се придобие по-добро разбиране на биохимичния механизъм на (-) - HCA регулиране на отлагането на мазнини в домашни птици.

Материали и методи

Материали и реактиви

Изоелектрични ленти с градиент на рН (IPG) (рН 3,0–10,0; NL, 17 см), урея, фармалит (рН 3–10), глицерол (87% т/т), Tris (степен на електрофореза), 1,2-ди ( диметиламино) етан (TEMED; реагент за чистота на електрофорезата), акриламид (40% разтвор; съотношение акриламид към бисакриламид, 37,5: 1), 3 - [(3-холамидопропил) диметиламонио] -1-пропансулфонат (CHAPS; електрофореза) тиокарбамид (клас ACS), дитиотреитол (DTT, клас електрофореза), йодоацетамид (клас електрофореза), минерално масло, петно ​​Coomassie G-250 и агароза с ниска точка на топене са получени от Bio-Rad. Комплекти за изолиране на пречистени митохондрии от животински клетки/тъкани са закупени от Genmed Scientifics, а комплектите за анализ на ензимната активност са закупени от Института по биотехнологии в Нанкин Jiancheng. За всички експерименти в това проучване е използвана вода с висока чистота, приготвена от системата за пречистване на водата с градиент Milli-Q (Millipore).

Екстракти от гарциния камбоджа

Гарциния камбоджа екстракти са получени от An Yun Co. Ltd. (Джънджоу, Китай). The G.arcinia cambogia екстрактите съдържаха 56–58% (-) - HCA, както и 12–14% целулоза, 5,5–6% α- d-мелибиоза, 2,5–3% β- d-лактин, 1,5–2% d-манопираноза, 11 –12% оксофенова киселина, 2-3% октадецилов алкохол, 3,5–4% коензим А и 1,5–2% неорганични елементи.

Животни и лечение

Общо 120 еднодневни пилета-бройлери (Ross 308) са получени от компания за развъждане на пилета Jiangsu Wuxi (Wuxi, Китай). Птиците бяха претеглени и разпределени в четири третирани групи, всяка от които включваше три повторения на 10 птици. Пилетата бройлери са хранени с една и съща основна диета от 1 до 49 дни (включително фазата на закваска [дни 1–21] и фазата на финишър [дни 22–49]). Диетичните хранителни нива са били в съответствие с хранителните изисквания за пилета-бройлери, препоръчани от Националния съвет за изследвания 25. Всички процедури за боравене с животни се извършват в строго съответствие с ръководството за грижа и използване на лабораторни животни, централно място в Нанкинския земеделски университет (Нанкин, Китай), а протоколът е одобрен от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните към Нанджинския земеделски университет ( Нанкин, Китай).

По време на фазата на финиширане, четирите групи пилета бяха допълнени с Гарциния Камбоджа екстракти в концентрации от 0, 25, 50 и 75 g/kg диета, които са еквивалентни на 0 mg/kg, 1000 mg/kg, 2000 mg/kg и 3000 mg/kg (-) - HCA съответно. В началната фаза пилетата-бройлери бяха настанени в осветени кошари с постоянно осветление и непрекъснато се осигуряваше вода. Температурата беше зададена на 32 ° C за първоначалните 5 d и след това постепенно намалява в съответствие с нормалните практики на управление, докато се достигне температура от 22 ° C. Бройлерите са отглеждани на пода при естествено осветление по време на фазата на финиширане. В края на експеримента птиците бяха случайно подбрани, лишени от храна за 12 часа, претеглени и умъртвени. Черният дроб се събира и бързо замразява в течен азот. Замразените тъкани се съхраняват при -80 ° C до анализ.

приготвяне на пробата

Цитоплазматичната и митохондриалната фракции се разделят чрез диференциално центрофугиране и се пречистват, като се използва двустепенен градиент, съгласно инструкциите, предоставени в комплекта. В този процес на екстракция пост-ядрената супернатанта и митохондриалните фракции бяха анализирани за митохондриални маркери ензими съгласно преди това докладвани методи 26 .

Двумерна електрофореза

Концентрацията на протеин на всеки от крайните супернатанти се измерва, като се използва тест Bradford 27 с говежди серумен албумин (BSA) като стандарт. Протеиновите екстракти (850 μg) се разделят чрез изоелектрофореза (IEF) с помощта на IPG ленти (pH 3.0–10.0; NL, 17 cm) в протеиновата система (Bio-Rad) при 20 ° C. Фокусирането се извършва за 1 h при 250 V, 1 h при 500 V, 1 h при 2000 V и 2,5 h при 8000 V; след това се задържа при 8000 V, докато общият потенциал достигне поне 60 000 V. След завършване на IEF, лентите бяха отстранени и уравновесени с леко разклащане в две следващи стъпки в продължение на 15 минути всяка в 5 ml буфер за уравновесяване (0,05 M Tris -HCl [рН 8,8], 6 М урея, 30% глицерол и 2% SDS), съдържащи допълнителни 0,1 mg DTT в първия етап и 0,1 mg йодоацетамид във втория етап. Второто измерение се провежда върху 12,5% полиакриламиден SDS гел, използвайки системата Multiphor (Amersham Biosciences). Двумерната електрофореза (2-DE) за всяка проба се повтаря три пъти.

Колоидното оцветяване Coomassie Blue G-250 на Neuhoff е извършено съгласно метода, описан от Джовани и др. 28. Оцветените гелове бяха сканирани и анализирани с помощта на PDQuest 2-D софтуер за анализ версия 8.0 (Bio-Rad). След подравняването, петната между геловете първо бяха автоматично съчетани и съответстващите петна бяха преразгледани ръчно, за да се гарантира точност. За по-нататъшен анализ бяха избрани само петна с качество> 50 и разлика в експресията> 2. Нормализирането на точковото количество беше проведено в режим „общо количество валидни петна“.

MALDI-TOF MS анализ

Изграждането на трипсин в гел на протеинови петна и подпомаганата с матрица лазерна десорбция/време на йонизация на полетната масова спектрометрия (MALDI-TOFMS; Reflex III, Bruker-Daltonics) бяха извършени с помощта на процедури, описани от Chen и др. 26. Търсенията на данни за пръстови отпечатъци на MS бяха извършени с помощта на търсачките MS-fit (http://prospector.ucsf.edu) срещу базата данни NCBInr за Gallus gallus, с параметри, определени за смилане на трипсин, две пропуснати разцепвания, пълна модификация на йодоацетамид (Cys), частична модификация на окислението на метионин, протеинова маса (± 20% от наблюдаваната протеинова маса, pI) и толеранс на масата за моноизотопни данни на 100 ppm. Смята се, че протеинът е идентифициран, когато има поне четири съвпадащи пептида и> 20% покритие на последователността. Функциите на протеините, идентифицирани чрез данни за пръстови отпечатъци на MS, са анотирани чрез запитване към базата данни за протеинови знания UniprotKB (http://www.uniprot.org/uniprot/).

Функционално анотиране на идентифицирани протеини

Генната онтология (GO) се използва широко за описание на протеиновата функция в стандартизиран формат 29. GO анализ на идентифицираните протеини беше извършен с помощта на базата данни за анотация 30. Инструментът GoMiner е използван за групиране на протеини според техния биологичен процес и молекулна функция, тъй като този инструмент предоставя преглед на основните биологични процеси, в които тези протеини участват. Също така извършихме анализ на обогатяването на пътищата, използвайки картите на пътищата на Киото енциклопедия на гени и геноми (KEGG) 31. В допълнение, анализът на изобретателността на пътищата (IPA) също се използва за изграждане на мрежа за взаимодействие и канонични пътища.

Резултати

Анализ на чистотата на изолираната митохондриална фракция

Чистотата на митохондриалните протеини се оценява чрез оценка на активността на специфични за митохондриите маркери ензими. Както е показано на фиг. 1, активността на цитохром С оксидазата (митохондриален маркерен ензим) в митохондриалната фракция е 5,55 пъти по-висока от тази в пост-ядрената супернатанта (фиг. 1А). Сукцинат дехидрогеназата е друг маркерен ензим, който е и единственият ензим, който се свързва с вътрешната митохондриална мембрана в клетките. Нашите резултати показаха, че активността на сукцинат дехидрогеназата в митохондриалната фракция е била 55,24 пъти по-висока от тази в пост-ядрената супернатанта (фиг. 1В). Тези резултати показват, че митохондриалната фракция е ефективно обогатена и следователно митохондриалните проби могат да бъдат използвани за анализ на протеини чрез 2-DE гел електрофореза.

пилета-бройлери

Дейностите на специфични за митохондриите ензими-маркери.

(A) Цитохром С оксидазна активност; (Б.) Сукцинатна дехидрогеназна активност. Стойностите представляват активността на ензимите-маркери в пост-ядрената супернатанта и митохондриалната фракция, изразена като промяна в абсорбцията на час на милиграм протеин.

Протеомен профил на черния дроб при пилета-бройлери, хранени (-) - HCA добавки

Въздействие на (-) - HCA върху протеиновия/ензимен профил на чернодробната митохондриална фракция при пилета-бройлери.

Стрелките във всеки гел показват диференцирано експресирани протеини/ензими, които показват поне 2,0-кратна разлика между контролната група и (-) - третирани с HCA проби. Значимостта на променените петна е оценена чрез матрична подпомогната лазерна десорбция/йонизационно време на полет (MALDI-TOF) масспектрометрия, а идентифицираните протеини/ензими са изброени в таблица 1.

Въздействие на (-) - HCA върху протеиновия/ензимен профил на чернодробната цитоплазматична фракция при пилета-бройлери.

Стрелките във всеки гел показват диференцирано експресирани протеини/ензими, които показват поне 2,0-кратна разлика между контролната група и (-) - третирани с HCA проби. Значимостта на променените петна беше оценена с помощта на матрична подпомагана лазерна десорбция/йонизационно време на полет (MALDI-TOF) масспектрометрия, а идентифицираните протеини/ензими са изброени в таблица 2.

Функционално анотиране на идентифицираните протеини

Схематична диаграма на Venn на идентифицираните протеинови петна.

Панели (А, Б) изобразяват диференциално експресирани протеини в митохондриите и цитоплазмата, съответно. (а) 1000 mg/kg (-) - HCA група, (b) 2000 mg/kg (-) - HCA група, (c) 3000 mg/kg (-) - HCA група. Диаграмата е съставена след анализ на идентифицираните протеини с помощта на инструмента GoMiner. Въз основа на тяхната категоризация, диференциално експресираните протеини бяха избрани за функционалния анализ.

Биологичен мрежов анализ на идентифицираните протеини

За да се изяснят метаболитните пътища, в които участват идентифицираните протеини, беше използван анализ на обогатяване на пътя на KEGG за анализ на диференциално експресираните протеини. Резултатите показаха, че идентифицираните протеини участват главно в цитратния цикъл, гликолизата/глюконеогенезата, метаболизма на пирувата, метаболизма на мастните киселини, метаболизма на бета-аланина, окислителното фосфорилиране и PPAR сигналния път. Важно е, че повечето от диференцирано експресираните протеини са участвали в метаболитни пътища (ACO2, ALDH2, ALDH6A1, ATP5H, CPOX, DLD, DLST, DYPS, GLUL, HGD, NDUFA10, NDUFS3, NDUFS8, PC, PCK2, ADSL, BHMT, BPN, ECHS1, GAMT, GART, HMGCS2, MAT1A, ME1, PAH, PGK, PDXK, PFAS, TPI1, PDHA1, PDHB, RGN, SDHA, SUCLG2, TST и UQCRC2).

Каноничен път, изграден с помощта на 66 диференцирано експресирани протеина.

Мрежата е създадена с помощта на Анализ на изобретателността на пътя. Червеното показва, че експресията на съответния протеин е била регулирана надолу, а зеленото показва, че експресията на съответния протеин е била регулирана в черния дроб на пилета-бройлери, които са получили (-) - HCA. Пълните и пунктирани линии представляват съответно директни и индиректни взаимодействия между протеините. Мрежовите форми са обяснени в легендата.

Дискусия

Въпреки че много изследвания съобщават, че (-) - HCA насърчава загуба на тегло 9,10, потиска de novo синтез на мастни киселини 13,32, увеличава окисляването на липидите 14,16 и увеличава енергийните разходи 33,34, докато точният биохимичен механизъм не е напълно ясен. За разлика от бозайниците, черният дроб е основният орган на липидния метаболизъм при домашните птици 21,22. Настоящото проучване представя глобалния профил на чернодробния протеин на пилета-бройлери след диетично (-) - добавяне на HCA: 40 и 26 диференцирано експресирани протеина са идентифицирани съответно в митохондриалните и цитоплазматичните. Тези диференцирано експресирани протеини могат да предоставят подробна биологична информация за действието на (-) - HCA при пилета-бройлери.

Предишни проучвания показват, че (-) - HCA е мощен инхибитор на ATP-цитрат лиаза 19 при животни и хора. Този ензим катализира разцепването на цитрат до оксалоацетат и ацетил-КоА и в крайна сметка ограничава наличието на ацетил-КоА единици, необходими за синтеза на мастни киселини и липогенезата 10,20. Основните биохимични механизми обаче не са добре разбрани; по-специално няма налична подробна информация за ефекта на (-) - HCA при пилета-бройлери. В това проучване не са наблюдавани значителни промени в нивата на експресия на АТР-цитратна лиаза при пилета-бройлери, на които са дадени (-) - HCA добавки, което противоречи на предишни доклади, че (-) - HCA е инхибитор на този ензим. Това несъответствие може да е възникнало, тъй като в настоящото проучване е установено ниво на експресия на АТР-цитрат лиаза протеин, а не неговата активност.

В птичия черен дроб по-голямата част от NADPH, използвана от синтазата на мастни киселини за катализиране на синтеза на палмитат, се генерира от ябълчен ензим (ME1) 46. Съобщава се, че нивото на чернодробния ябълчен ензим е в положителна корелация със скоростта на синтез на мастни киселини, процента телесни мазнини и процента коремна мазнина при пилетата 47. В настоящото проучване лечението с (-) - HCA повишава нивото на експресия на NADP-зависим ME1 протеин при пилета-бройлери. По този начин ние смятаме, че потискащият ефект на (-) - HCA върху отлагането на мазнини е предизвикан чрез намаляване на нивото на цитозолния ацетил-CoA и NADPH, които са необходими за синтеза на мастни киселини, чрез инхибиране на експресията на протеин ME1.

Нашите настоящи резултати показват, че експресията на белтъка 1 на еноил-КоА хидратаза 1 (ECHS1), който е активен в бета-окислителния път на метаболизма на мастните киселини 48, е била регулирана в черния дроб на пилета бройлери след (-) - HCA лечение . Съобщава се, че понижаването на регулацията на ECHS1 допринася за натрупването на липиди в черния дроб 49,50. Освен това, нашите резултати показаха, че нивото на експресия на протеин на фосфоглицерат киназа 2 (PGK2) се повишава при пилета-бройлери след третиране с (-) - HCA. Глицеролът може да се превърне в α-фосфоглицерат чрез действието на PGK, след което той навлиза в глюконеогенния път в черния дроб 51. По този начин горните данни показват, че друг важен ефект от (-) - HCA регулирането върху отлагането на мазнини в корема е насърчаването на бета-окисляването на мастните киселини чрез повишено регулиране на експресията на протеин ECHS1 при пилета-бройлери.

В заключение, настоящите данни показват, че (-) - HCA инхибира отлагането на мазнини при пилета-бройлери главно чрез тези два механизма: (1) инхибиране на синтеза на мастни киселини чрез намаляване на доставката на ацетил-КоА, което се постига главно чрез насърчаване на цикъла на трикарбоксилната киселина (повишено регулиране на експресията на протеин PDHA1, PDHB, ACO2, DLST) и инхибиране на експресията на протеин ME1; (2) насърчаване на бета-окисляването на мастни киселини чрез повишено регулиране на експресията на протеин ECHS1. Освен това IPA показа, че тези диференцирано експресирани протеини участват в гликометаболизма и липидния метаболизъм, включително PDHA1, PDHB, ECHS1 и ME1 в каноничния път, което отразява биохимично значим (-) - HCA-индуциран механизъм за намаляване на мазнините при пилета-бройлери. В допълнение, глобалният анализ на експресията на протеини може да предостави основа за по-нататъшно изучаване на механизма на (-) - HCA в инхибирането на наддаването на телесно тегло и отлагането на мазнини при животните.

Допълнителна информация

Как да цитирам тази статия: Пенг, М. и др. Потискане на отлагането на мазнини при пилета-бройлери чрез (-) - добавяне на хидроксилимонена киселина: перспектива на протеомиката. Sci. Представител. 6, 32580; doi: 10.1038/srep32580 (2016).