Резюме

Диетичните модели са добре известни, че допринасят за метаболитния синдром и свързаните с него нарушения. Оценихме въздействието на краткосрочната експозиция на вестернизирана диета (WD) върху системните плазмени метаболомични промени в кохорта от възрастни мъжки павиани. В това пилотно проучване петима мъжки павиани (n = 5), отглеждани и поддържани на стандартна диета на маймуни-чау (високо сложни въглехидрати, ниско съдържание на мазнини), са били изложени на WD предизвикателство (високо съдържание на наситени мазнини и прости въглехидрати) в продължение на 7 седмици (49 г), последвано от 57-дневен период на измиване на маймунски чау (106 г). В допълнение към наблюдението на клиничните мерки, ние използвахме цялостна двумерна платформа за масова спектрометрия с време на полет (2D GC-ToF-MS) за оценка на метаболомичните промени в плазмата в три времеви точки. Двадесет и три метаболита бяха променени в отговор на WD (49 d), но реакцията при животните беше силно променлива. Всички животни са имали много различен метаболитен профил от този на изходното ниво (0 d) и периодът на измиване е довел до относително хомогенно метаболитно състояние при всички животни. Краткосрочното излагане на WD доведе до дългосрочни промени в метаболитния профил, което предполага „нулиране“ на метаболитната програма.

краткосрочната

1. Въведение

Дългосрочните промени в телесното тегло корелират с характерни промени в серумните концентрации на метаболит [9]. Промените в нивата на триглицеридите в плазмата, холестерола и глюкозата често са клинични прояви на наддаване на тегло в отговор на WD. Интересното е, че подобреното хранене, диети и загуба на тегло не водят неизменно до връщане към нормалните плазмени концентрации на метаболити и тези променени плазмени нива на специфични метаболити могат да допринесат за повишения риск от сърдечно-съдови заболявания, наблюдаван при пациенти с повтарящи се цикли на наддаване и загуба на тегло (често наричан йойо диета или колоездене) както при жените [10, 11], така и при мъжете [12]. Въпреки това, точният модел на метаболитни промени по време на това тегло не е характеризиран и не е известно колко бързо експозицията на WD (със или без увеличаване на теглото и последваща загуба) причинява дългосрочни промени.

С появата на съвременните метаболомични технологии, като свързана с газова хроматография масова спектрометрия, вече е възможно да се провеждат изчерпателни и безпристрастни анализи на серумни проби, за да се характеризират сложните метаболитни промени в резултат на наддаване на тегло и промени в режима на хранене. В неотдавнашно проучване в рамките на 6-8 седмици при хора доброволци на WD се предизвиква 8% увеличение на теглото [13]. Подробен метаболомичен анализ разкрива значителни промени в отговор на промяната в диетата и наддаването на тегло при участниците в проучването. Анализът предполага, че дори краткосрочното приложение на WD и произтичащото от него краткосрочно наддаване на тегло, водят до метаболомични промени, които продължават дори след като участниците са били върнати към нормална диета и първоначалното наддаване на тегло е обърнато. Констатациите обаче са силно вариращи сред индивидите, което предполага междуиндивидуални фактори (като генетични фактори или предишен начин на живот), които също допринасят за наблюдаваната реакция и подчертават предизвикателствата пред изследването на това явление при възрастни пациенти или доброволци.

Модели на нечовекоподобни примати (NHP), като бабуините, са широко използвани за изследване на кардиометаболитни нарушения в отговор на западни и други диети [14-17]. Тези проучвания се възползват от сходството в метаболизма и хранителните нужди на тези животни в сравнение с хората и контролирана среда, в която диети с определен състав могат да се хранят, без да се налага да се отчитат променливите предишни експозиции на животни.

За това проучване ние формулирахме WD, имитиращ консумацията на запад в диетата при хората, която е с високо съдържание както на наситени мазнини, така и на прости въглехидрати. Здравите възрастни бабуини (Papio hamadryas) бяха изложени на тази предизвикателна диета в продължение на 7 седмици и след това се върнаха към нормалната маймунска чау, здравословна диета с ниско съдържание на мазнини. Приложихме метаболомични анализи, за да оценим промените, индуцирани от тази експозиция на WD, както е отразено в състава и разпределението на плазмените метаболити, и след това оценихме дали връщането към нормална диета обърна промените, предизвикани от WD. Както описваме по-долу, наблюдавахме значителни промени в плазмените метаболити при павианите след 7 седмици на WD, независимо от наддаването на тегло или други клинични серумни мерки. Интересното е, че нивата на метаболит не са се върнали до нивата преди предизвикване, дори след 56 d консумация на маймунски чау, което предполага, че дори краткосрочното излагане на WD води до дългосрочни промени в нивата на основните метаболити.

2. Експериментална секция

2.1 Кохорта и състав на предизвикателната диета за изследване на павиана

Сравнение на изследваните диети.

2.2 Клинични анализи

2.3 Метаболомен анализ, използвайки GC-MS

2.4. Обработка на сурови GC-MS данни

Данните от GC-MS бяха предварително обработени, почистени и подравнени с помощта на ChromaToF версия 4.71.0.0 (LECO Corp., St. Joseph, MI, USA), следвайки настройки, описани другаде [22, 24]: т.е. S/N: 25; ширина на пика: 0,15, отместване на основната линия: 1; m/z обхват: 40-600. Идентификацията на метаболитите включва консултация със спектралните библиотеки MSRI с отворен код на базата данни Golm Metabolome, достъпна от Института по физиология на растенията Max-Planck, Golm, Германия (http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/gmd/gmd .html) за съвпадение на мас спектрите и индексите на задържане (RI) [25] и NIST Mass Spectral Reference Library (NIST11/2011; Национален институт за стандарти и технологии, САЩ). За количествено определяне бяха използвани основни пикови области за отделни метаболитни спектри. Филтрираните сурови GC-MS данни включват данни (основни пикови области) от пет биологични повторения. Данните за количествено определяне на отделни метаболити са събрани в общ набор от данни, който включва попадения от двете бази данни.

2.5 Статистически анализи

Стандартните статистически анализи (обобщена статистика) бяха извършени с помощта на статистическия софтуер R (Версия 3.5.0, http://www.R-project.org) [2, 26] и Microsoft Excel. Нормализирани (вътрешни стандарти), трансформирани (log2), вменени и мащабирани пикови области, представителни за относителните количества метаболити, бяха получени с помощта на DeviumWeb [27] и са представени в таблици и фигури. Стойностите, отчетени във всички таблици и текст, са представени като средства и разликите се считат за значими, когато P Променливост в телесното тегло, отразяваща индивидуалния отговор на предизвикателството с диетата. Линейна диаграма, показваща промяна в телесното тегло от 0 до 49 d и до 106 d за петте павиани в проучването.

Линейна диаграма, показваща промяна в телесното тегло от 0 до 49 d и до 106 d за петте павиани в проучването.

3.2. Отговор на клиничните мерки към периода на измиване след излагане на WD

3.3 Промени в метаболома на павиана в плазмата в отговор на краткотрайно излагане на WD и при връщане към диетата с чау

Графики на мустаци (показващи долните (Q1) и горните (Q3) квартили и медианата), показващи относително изобилие от метаболит на (А) аминокиселини, (Б) мастни киселини (* са наситени мастни киселини), и (° С) въглехидрати, във всеки момент от време 0 d, 49 d и 106 d. Само метаболити с P × 27, 85 метаболити) демонстрират модел от 0, 0, -1, което показва, че няма промени в метаболитите от време 0 d до 49 d, последвано от спад в нивата на метаболити (-1) при 106 д. 85-те метаболита в първия модел принадлежат най-вече на метаболизма на аминокиселините (аспарагин, глицин, аспарагинова киселина, валин, изолевцин, левцин, треонин, триптофан, тирозин, пролин, цистеин и глутаминова киселина), азотен метаболизъм (глицин, хидроксиламин), метаболизъм на бутаноат (бутанал, маслена киселина, янтарна киселина), биосинтез на мастни киселини (миристинова киселина, додеканова киселина и капринова киселина), холестерол, малтоза, мио-инозитол, мио-инозитол-фосфат, уридин, креатинин, канаванин и др. Вторият модел (0, 1, -1) се основава на 20 метаболита (P-стойност, 1,3 × 10 × 7), които принадлежат към метаболизма на аминокиселините (глутамин, серин, лизин, орнитин, 1-метил хистидин) етанол и глицерол.

За метаболитите двата модела са значими с 85 и 20 метаболита, показващи модели на 0 (непроменен), 0 (непроменен), -1 (по-нисък) (А) и 0 (непроменено), 1 (по-високо), -1 (по-ниско) (Б), съответно.

Поразително е, че всички метаболити в тези две групи са имали по-ниски нива на циркулираща плазма при 106 d, в сравнение с началото на проучването (0 d). Противно на очакванията, нивата не просто се връщат към изходното ниво след измиване, а се установяват на различна, по-ниска „нормална зададена точка“, което предполага, че краткосрочното предизвикателство за WD, независимо от непосредственото въздействие по време на диетата, е имало дълго време термични последици, процес, който нарекохме „метаболитно препрограмиране“ [46]. Най-очевидната визуализация на това явление е представена в парцелите в Фиг. 2 където нивата са по-ниски и варирането между животните намалява на 106 d в сравнение с 0 d и 49 d.

За да се разбере приноса на изобилието от метаболити в групирането и разделянето на трите точки от времето на това диетично предизвикателство, беше извършен йерархичен клъстериращ анализ (HCA), за да се класифицират метаболитите в клъстери въз основа на 25-те метаболита, различни за средните групи (ANOVA ). Това групиране също предполага по-тясна връзка от 0 d с 49 d в сравнение с нивата на метаболитите след периода на измиване при 106 d (Фигура S1). Освен това горните клъстери са образувани най-вече от аминокиселини. Отново, този анализ посочва ясните метаболитни разлики в 0 d и 106 d проби, потвърждавайки „препрограмиране“ на метаболитното състояние поради краткосрочното излагане на WD. Това категорично предполага, че промените в плазмените метаболити след 106 d наистина отразяват промени в основната системна метаболитна регулация, а не просто резултат от физиологични промени, като увеличаване на теглото, предизвикано по време на експозицията на WD.

3.5. Метаболитната дисрегулация, предизвикана от WD, предотврати връщането към изходното ниво

Освен това разгледахме метаболитните промени в павианите на 106 d в сравнение с 0 d изходните нива. Стратегията за намаляване на измерението на неконтролирана PCA е използвана за намаляване на всички метаболити, измерени в плазмата, в по-малък брой ортогонални променливи, които разкриват групирани и диференцирани отговори на павианите към промени в диетата с интерпретируема визуализация. След оценка на PCA, получените графики обясниха 77% от вариацията от два компютъра (PC1-61,8% и PC2-15,4%), приписани на вариацията от компонентите на времето (и диетата) (Фиг. 4А). Беше проведен контролиран подход за класификация, PLS-DA анализ, за ​​да се посочат групирани отговори на бабуините на диета, където първите два компютъра обясниха 80% от вариациите в групираните отговори (Фигура 4В). Групирането на 106 d проби отразява намалената променливост на изобилието от павианови метаболити и ясно отделено от плазмените проби 0 d и 49 d.

(A) PCA и (Б.) PLS-DA анализ. PCA се извършва, като се използват пет реплицирани данни за относително количество метаболити и генерираните PC1 и PC2 се начертават. Графиките на резултатите от PCA показват ясно разделяне на групите проби (три времеви точки) въз основа на изобилието от 115 метаболита.

По-нататъшен анализ на метаболитите, задвижващи разделянето, за идентифициране на дискриминационни метаболити, използвайки биплоти, получени от PLS-DA анализ, разкрива, че захарите (глюкоза, галактоза, маноза), уреята и мастните киселини (палмитинова и стеаринова киселини) показват по-висок дискриминационен потенциал от други (Фиг. 5А). Peining и сътр. [13] отдава тази промяна на намаления катаболизъм поради увеличения прием на калории, за да обясни промяната на метаболитите във времевите точки в тяхното проучване за отслабване [13].

(A) Биплот от PLS-DA анализ, показващ метаболитите, допринасящи за клъстерите от времеви точки. За простота са показани само метаболитите с по-висок дискриминационен потенциал. (Б.) Линейна диаграма, показваща тенденциите на метаболитите (аминокиселини и мио-инозитол) през периода на изследване.

Peining и сътр. също показа тенденции в метаболитите като изолевцин, мио-инозитол, триптофан, серин и глутаминова киселина [13], които се промениха в същата посока като промените, наблюдавани в нашето проучване. Те съобщават за клъстер от биомолекули, който е увеличен при наддаване на тегло, но не успява да се върне към изходното ниво в края на периода на отслабване, включително фолат, фенилаланин и молекули, свързани с разграждането на аминокиселини с разклонена верига (BCAA) [13].

4. Заключителни бележки

В нашето изследване за павиани, краткосрочното излагане на WD не е предизвикало значителни метаболомични промени след 7 седмици (49 d). Въпреки това, пробите, събрани след периода на измиване от 57 d, показват мащабни метаболитни промени при тези животни, което води до нива на метаболит, които са по-ниски спрямо точката от 0 d време и по-малко променливи за всички животни. Нивата на метаболитите след измиване не се върнаха обратно към нивата на изобилие от 0 d изходно ниво, което предполага метаболитно препрограмиране със създаването на строго регулирана и контролирана нова „нормална зададена точка“ в отговор на краткосрочното предизвикателство за WD. Тези резултати дават нова представа за потенциалните цели и свързаните с тях пътища, които отразяват метаболитния здравен статус при павианите. Някои от тези метаболити и метаболитни сигнатури може да са показателни за дългосрочни физиологични промени и чувствителност към хронични заболявания. Ще бъдат необходими допълнителни проучвания за допълнително изясняване на метаболитните последици от тези промени в плазмените метаболити и как това променя метаболитната регулация при тези животни.

Принос на автора

AC, LAC, MO проектираха изследването; VM, RPU, BBM проведоха изследването; MO, LAC, AC осигуряват основни реактиви и материали; BBM анализира и интерпретира данни, BBM, MO, LAC, JSP са написали ръкописа; и носят основна отговорност за окончателното съдържание и редакции. Всички автори прочетоха и одобриха окончателния ръкопис.

Разкриване

Благодарности

Изследванията, докладвани в този ръкопис, са подкрепени с безвъзмездна помощ от Националния здравен институт (NIH): P01 HL028972. Това разследване използва ресурси, които бяха подкрепени от гранта на Югозападния национален център за изследване на примати P51 RR013986 от Националния център за изследователски ресурси, NIH, понастоящем подкрепен от Службата за програми за изследователска инфраструктура (ORIP), NIH чрез грант P51 OD011133. Това разследване е проведено в съоръжения, построени с подкрепата на ORIP чрез номера на безвъзмездни средства C06 RR14578, C06 RR15456, C06 RR013556 и C06 RR017515.

подкрепяща информация

S1 Таблица. Клинични мерки (сурови данни), получени от 5-те животни, хранени с WD диета в продължение на 49 дни и върнати към чау диета.

Таблица S2. Списък на 115 идентифицирани метаболита и тяхното относително изобилие, получени с помощта на 2D GC-ToF-MS платформа заедно с техните идентификатори. Идентификаторите са KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, HMDB: Human Metabolome Database, PubChem ID, ChEBI, METLIN IDs.

S3 Таблица. Обработени, нормализирани и трансформирани данни за относително изобилие на метаболит за трите точки от време, 0, 49 и 106 дни, както и средните промени, SD, RSD и промени в пъти (FC).

Таблица S4. ANOVA и post-hoc (Fisher’s LSD) резултати за данните за изобилието на метаболити, проведени за трите точки от времето.

S5 Таблица. Анализ на обогатяване за базирани на KEGG пътища, представени от метаболитите, количествено определени в това проучване.

S6 Таблица. Анализ на модела, показващ списъка и стойностите на 85 и 20 метаболита, съответстващи на два модела, (0, 0, -1) и (0, 1, -1), съответно.

S1 Фиг. Йерархичен клъстерен анализ (HCA) на средно и нормализирано количество метаболити, получени от пет биологични повторения през времевите точки 0, 39 и 106 d. Червеното и зеленото показват съответно увеличаване и намаляване на концентрациите на метаболитите. Стойностите бяха подложени на средно групиране на връзките (разстояние на Пиърсън). Скалата показва високо (3, червено) до зелено (−3, ниско) изобилие.