Подобни теми на научна статия във ветеринарната наука, автор на научна статия - Анна Беликова, Мария Микулашова, Роман Душински

Академична изследователска работа на тема "Пробиотични потенциални и безопасни свойства на Lactobacillus plantarum от словашко сирене Bryndza"

Издателска корпорация Hindawi BioMed Research International

потенциални

Том 2013, идентификатор на статия 760298, 8 страници ^ W M

Пробиотични потенциални и безопасни свойства на Lactobacillus plantarum от словашко сирене Bryndza

Анна Беликова, 1 Мария Микуласова, 1 и Роман Дусински2

1 Катедра по молекулярна биология, Факултет по естествени науки, Университет Коменски, Mlynska Dolina, 84215 Братислава, Словакия

2 Катедра по генетика, Факултет по естествени науки, Университет Коменски, Mlynska Dolina, 84215 Братислава, Словакия

Кореспонденцията трябва да бъде адресирана до Роман Дусински; [email protected] Получено на 29 април 2013 г .; Ревизиран на 12 юли 2013 г .; Приет на 4 август 2013 г. Академичен редактор: Али Голамрезанежад

Сто и двадесет и пет киселинно-устойчиви предполагаеми лактобацили бяха изолирани от словашкото сирене Bryndza и скринирани за тяхната антимикробна активност срещу осем бактериални патогени с помощта на анализ на точков агар От двадесет и шест щама Lactobacillus със силно инхибиращо действие, двадесет бяха идентифицирани като Lactobacillus plantarum и шест като Lactobacillus fermentum. Най-активните единадесет изолати на L. plantarum бяха допълнително характеризирани in vitro за някои пробиотични и безопасни свойства. Само три изолати K10, K21 и ZS07 показват способността да растат над 50% в присъствието на 0,3% жлъчка. Силна ефективност на деконюгация беше определена за CK06 и K21. Най-високата активност на ^ -галактозидаза е показана при изолати ZS11, B01, CK06 и ZS07. Само три от щамовете са имали способността да произвеждат тирамин: CK06, LM1 и ZS11. Щамовете K09, K21, ZS11 и ZS15 са податливи на всички тествани антибиотици. Анализът на резултатите потвърди, че изолатите L. plantarum ZS07 и K21 са най-подходящи за пробиотична употреба поради желаните им пробиотични и безопасни характеристики.

Пробиотиците се определят като живи микроорганизми, които, когато се консумират в подходящи количества, водят до полза за здравето на гостоприемника [1]. Видовете от родовете Lactobacillus и Bifidobacterium са сред млечнокиселите бактерии, най-често използвани като пробиотици във фуражите за животни и човешките храни. Според "Американската администрация по храните и лекарствата" те обикновено се считат за безопасни (статус GRAS) поради тяхната дълга история на безопасна употреба във ферментирали храни и присъствието им в нормалната чревна и урогенитална микробиота на хората. Няколко вида, включително L. plantarum и L. fermentum, са получили статут на квалифицирана презумпция за безопасност (QPS), даден от Европейския орган за безопасност на храните (EFSA). Съгласно препоръките за оценка на пробиотиците, предполагаемите пробиотични щамове трябва да бъдат изследвани за основните им функционални свойства (устойчивост на стомашна киселинност и жлъчни соли, производство на антимикробни съединения, способност за модулиране на имунните реакции и адхезия към чревните тъкани) и свойства на безопасност като като антибиотична резистентност и производство на биогенни амини при тестове in vitro. Други препоръки включват липсата на хемолитик

активност и преносима антибиотична резистентност на щамовете, където безопасността трябва да бъде доказана при животински модели [1].

Словашкото сирене Bryndza е естествено, намазвано сирене с характерна миризма и вкус, произведено по традиционния метод: чрез смилане на бучка от зряло овче сирене или чрез смилане на смес от овче сирене и краве сирене. Сиренето Bryndza включва няколко преобладаващи млечнокисели бактерии (LAB), принадлежащи към родовете Lactobacillus spp., Enterococcus spp., Lactococcus spp. И Streptococcus spp. [2, 3]. L. plantarum са повсеместни млечнокисели бактерии, които се откриват в среда като храни (млечни продукти, ферментирало месо, зеленчуци, плодове и напитки), дихателни, стомашно-чревни и генитални пътища на хора и животни, както и в канализацията и растителния материал.

Няколко изолати на L. plantarum доказаха способността си да преживяват стомашния транзит и да колонизират чревния тракт на хора и други бозайници [4, 5]. Някои проучвания показват, че наред с другите ефекти, консумацията на L. plantarum намалява пренасянето на фекални ентеробактерии, намалява някои рискови фактори за коронарна артериална болест и води до дозозависимо намаляване на симптомите на IBS [6]. Изглежда, че при изследванията за щамове с пробиотичен потенциал,

Храната може да бъде и добър източник на подходящи изолати за намиране на нови пробиотични щамове за функционални хранителни продукти. Традиционната препоръка пробиотичните щамове за хората да идват от хора (критерий за специфичност на видовете) се смекчава, тъй като понастоящем няколко пробиотични продукта включват LAB (NSLAB), като L. paracasei и L. plantarum. Тези хранителни и здравни продукти, съдържащи пробиотични щамове на L. plantarum, се предлагат на пазара [6].

Целите на нашето изследване бяха (1) да се характеризират щамовете на L. plantarum, изолирани от сирене Bryndza и (2) да се изберат най-подходящите щамове за употреба като пробиотици, в съответствие с техните функционални и безопасни характеристики, включително антагонистична активност срещу патогени, устойчивост на жлъчката, деконюгация на жлъчна сол, ^ -галактозидазна активност, антибиотична резистентност и производство на биогенни амини.

2. Материали и методи

2.1. Вземане на проби и изолиране на киселиноустойчиви лактобацили. От словашкото сирене Bryndza са изолирани общо 125 предполагаеми киселинно толерантни лактобацили. Пробите от Bryndza са получени от петима търговски производители, а именно, Brezrnn (B), Cerveny Kamen (CK), Kluknava (K), Liptovsky Mikulas (LM) и Zvolenska Slatina (ZS). Bryndza от Brezrnn е направен от прясно овче сирене, от непастьоризирано овче мляко. Други проби от Bryndza, а именно LM и ZS, са направени от прясно овче сирене (от пастьоризирано овче мляко) и краве сирене от краве, направено от пастьоризирано краве мляко, докато CK и K са направени от буче сирене, съхранявано за няколко месеца и краве сирене на буци, направено от пастьоризирано краве мляко, при което бузите сирене на овце представляват повече от 50% от сместа в сухо вещество.

LAB бяха изследвани за тяхната устойчивост на ниско рН. Накратко, пробата от сирене се емулгира в стерилен 2% (w/v) тринатриев цитрат при 45 ° С в продължение на 3 минути и клетките се събират чрез 5 минути центрофугиране при 12000 xg. Пелетите се промиват два пъти с 1/4 разтвор на Рингерс и накрая се суспендират в MRS среда (рН 2.0, коригирано с 1N HCI). Бактериите се култивират при 37 ° С в продължение на 3 часа, след това се разреждат последователно в стерилен физиологичен разтвор и се поставят в три екземпляра върху MRS агар. Плаките се инкубират анаеробно в продължение на 48 часа при 37 ° С (Bugbox, Ruskinn Technology, UK). Двадесет и пет произволно избрани колонии от проби от сирене Bryndza от всеки производител се пречистват чрез две последващи субкултури и след това се подлагат на микроскопско изследване, оцветяване по Gram и тест за каталаза. Предполага се, че колониите на каталаза-отрицателни, Грам-положителни пръчки са лактобацили. Те се съхраняват в MRS, съдържащ 20% глицерол при -80 ° C.

2.2. Прожекция за антагонистична активност. Антагонистичната активност на изолатите се оценява, както е описано другаде [7]. Култури от изолати през нощта бяха забелязани върху повърхността на агаровите плочи (MRS-0,2 с 1,2% агар) и инкубирани анаеробно в продължение на 24 часа при 37 ° С (Bugbox, Ruskinn Technology, UK). 100 ^ L18 h култури от индикаторни щамове се инокулират в 7 ml мек BHI агар (съдържащ 0,7% агар) и се изсипват върху плочата, върху която е отглеждан производителят. След аеробна инкубация в продължение на 48 часа при 37 ° С плочите бяха

проверени за зони на инхибиране. Инхибирането се оценява положително, ако ширината на чистата зона около колониите на продуциращия щам е била 1 mm или по-голяма. Следните патогени и опортюнистични патогени бяха използвани като индикаторни щамове: Listeria monocytogenes CCM 4699; Staphylococcus lentus CCM 3472; Acinetobacter calcoaceticus CCM 4503; Sphin-gomonas paucimobilis CCM 3293; и Salmonella enterica subsp. enterica, серовар Typhimurium щам TA100 CCM 3812 от Чешката колекция на микроорганизми, Бърно, Чехия, Enterococcus faecalis V583 от Университета в Оклахома, САЩ, Staphylococcus aureus SSV25 и Staphylococcus epidermidis SSV30 (от нашата колекция).

Щамовете, проявяващи антагонистична активност, бяха допълнително тествани за тяхната активност на безклетъчни неутрализирани супернатанти (CFNS), като се използва методът за тестване на агар на място от Uhlman et al. [8]. Накратко, CFNS са получени от култури, отглеждани в MRS бульон в продължение на 18 часа при 37 ° С. След центрофугиране на културата при 12000 xg в продължение на 15 минути, супернатантата се регулира до рН 6.5 с NaOH и се загрява при 100 ° С в продължение на 5 минути. Супернатантите бяха тествани срещу същите индикаторни щамове, използвани по-рано.

2.3. Идентифициране на избрани изолати. Двадесет и шест предполагаеми лактобацили бяха идентифицирани на видово ниво чрез системата API 50 CH и 50 CHL среда (Bio-Merieux, Франция), съгласно инструкциите на производителя. Резултатите са записани след 2 дни инкубация при 37 ° C и са оценени със софтуера за идентификация ApilabPlus, предоставен от Bio-Meerieux.

2.3.1. Приготвяне на клетъчни лизати. Две колонии изолати бяха суспендирани в 50 ^ L трис-HCI-EDTA-физиологичен разтвор (рН 8.0). Бактериалната суспензия се инкубира в продължение на 10 минути при 95 ° С и се центрофугира при 18600 xg в продължение на 2 минути и получената супернатанта служи като PCR шаблон.

2.3.2. PCR идентификация. Изолатите бяха идентифицирани с помощта на специфичните за вида праймери за L. plantarum LbP11 (5 'AATTGAGGCAGCTGGCCA 3') и LbP12 (5 'GATTAC-GGGAGTCCAAGC 3') [9] и

Lfer3 (5 'ACTAACTTGACTGATCTACGA 3') и Lfer4 (5 'TTCACTGCTCAAGTAATCATC 3') [10]. Праймери Lb1 (5 'AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3') и Lb2 (5 'CGG-TATTAGCATCTGTTTCC 3') бяха използвани като положителен контрол на PCR с праймери LbP11 и LbP12. Всички праймери, използвани в това проучване, са получени от Invitrogen (САЩ). PCR амплификация се извършва в 25 ^ L реакция, съдържаща 0,5 ^ L dNTP (10 ^ M във всеки dNTP), 0,75 ^ L праймер (10 рМ), 0,42 ^ L клетъчен лизат, 2,5 ^ L реакционен буфер (10x), 0,17 ^ L Taq ДНК полимераза (5 U/^ L, GeneCraft, Германия) и 18,9 ^ L дейонизирана вода. PCR реакциите бяха проведени с PTC-100 Peltier термичен циклер (MJ изследвания, САЩ). Сместа се денатурира за 5 минути при 95 ° C и се циклира 35 пъти при 94 ° C за 30 s, 54 ° C за 1 min (55 ° C за L. fermentum) и 72 ° C за 1 min, последвано от окончателно 10 минути удължаване при 72 ° C. PCR продуктите се разделят чрез електрофореза върху 1,5% агарозен гел, оцветен с етидиев бромид, визуализиран под UV светлина. Размерът на всеки PCR продукт се определя чрез сравнение със 100 bp ДНК стълба (Fermentas, Латвия).

L. plantarum CCM 4281 и L.fermentum CCM 91 бяха използвани като контроли за идентификация на видовете.

Генетичното разнообразие на изолатите се определя чрез (GTG) 5-PCR съгласно Versalovic et al. [11] като се използва единичният олигонуклеотиден праймер (5'GTGGTGGTGGTGGTG 3 '). Профилите на rep-PCR бяха анализирани от софтуера Bio-1D (Vilber Lourmat, Франция). Приликата между дигитализираните профили беше изчислена с помощта на коефициента на Джакард и беше получена дендрограма на средно свързване (UPGMA).

2.4. Устойчивост на жлъчката. Преживяемостта на изолатите в присъствието на жлъчка се определя по метода на Vinderola и Reinheimer [12]. Изолатите се инокулират (2% w/v) в MRS бульон с 0,3%, 0,5% или 1% (w/v) жлъчка (Sigma-Aldrich, САЩ). След 24 h култивиране при 37 ° С, A560nm беше измерен и сравнен с контролна култура (без жлъчни соли). Резултатите са изразени с процента на растеж (A560 nm) в присъствието на неподвижни соли в сравнение с контролата.

2.5. Деконюгация на жлъчна сол. Изолатите бяха набраздени върху плаки с жлъчна сол, като се използва MRS агар с 0,5% (w/v) натриеви соли (Sigma-Aldrich, САЩ) от таурохолова киселина (TC), тауродеоксихолова киселина (TDC), гликохолова киселина (GC), и гликодезоксихолова киселина (GDC) и те бяха анаеробно инкубирани при 37 ° С в продължение на 72 часа. Способността на изолатите да деконюгират жлъчните соли е декларирана чрез образуване на утаена жлъчна киселина около колониите - непрозрачен ореол [13].

2.6. p-галактозидазна активност. ^ -галактозидазната активност на цели клетки се определя по метода на Miller [14], модифициран от Vinderola и Reinheimer [12]. Активността на ^ -галактозидазата с о-нитро - ^ - D-галактопиранозид (Sigma-Aldrich, САЩ) като реакционен субстрат се определя в култури, инокулирани в лактоза-MRS бульон. След реакцията се определят оптични плътности както при 420, така и при 560 nm и се изчислява активността на ^ -галактозидаза (единици на Милър), както следва: 1000 x [A420 - (1,75 x A2560)/(15 min x 1 ml x A1560) j, където A1560 е абсорбцията непосредствено преди анализа, а A2560 е стойността на абсорбция на реакционната смес.

2.7. Изпитване за чувствителност към антибиотици. Минималната инхибиторна концентрация за щамовете 11 L. plantarum се определя чрез тест за микроразреждане на бульона. Отделни колонии бяха суспендирани в 5 ml стерилен физиологичен разтвор до мътност 1 по скалата на McFarland и допълнително разредени 500 пъти в LSM среда (Iso-sensitest бульон: MRS, 9: 1). Петдесет ^ L от разредените бактериални суспензии се добавят към всяка ямка на ръчно предварително направени MIC микротитърни тестови плаки (съдържащи различните концентрации на антибиотични тестове във всеки 50 ^ L обем от LSM бульон на гнездо). Антибиотиците бяха тествани в границите на концентрациите (mg/L): ампицилин (0.032-16), гентамицин (0.5-256), канамицин (2-256), еритромицин (0.016-16), клиндамицин (0.032-16), тетрациклин (0,12-64) и хлорамфеникол (0,12-64). Плаките се инкубират при 37 ° С в продължение на 24 часа. MICs бяха определени като най-ниската антибиотична концентрация, която инхибира видимия бактериален растеж, измерена турбидиметрично (A650nm) от четец на микроплаки

(Varioskan Flash, Thermo Scientific, Финландия). Възприемчивите и устойчиви щамове бяха разграничени според точките на прекъсване (граничните стойности), докладвани от EFSA [15]. Съответно щамове, показващи MICs по-високи от съответните гранични стойности, се считат за устойчиви.

2.8. Производство на биогенни амини. Производството на биогенни амини се изследва върху декарбоксилиращи среди с плочи, съдържащи 2% L-хистидин-монохидрохлорид, L-тирозин динатриева сол или L-орнитин монохидрохлорид (Sigma-Aldrich, САЩ), както е описано от Joosten и Northolt [16]. Изолатите се субкултивират два пъти в декарбоксилиращ бульон, допълнен със съответния аминокиселинен предшественик (1 g/L) и 1 mg/L пиридоксал 5-фосфат и се инкубират при 37 ° С за 24 часа. 1 ^ L от всяка култура се забелязва върху декарбоксилиращите агари и след това плаките се инкубират анаербично (Bugbox, Ruskinn Technology, UK) при 37 ° С за 72 часа. Освен производството на амин във всички среди, лилав хало се интерпретира като положителна реакция, с изключение на среда за декарбоксилиране, съдържаща тирозин, където положителният отговор беше представен от бистър хало, заобикалящ колониите. Експериментите са извършени три пъти.

3. Резултати и дискусия

Колекция от 125 предполагаеми киселинно-устойчиви лактобацили е изолирана от проби сирене Bryndza от пет търговски дистрибутора. Всички изолати бяха избрани въз основа на способността им да преживяват 3 h култивиране при рН 2,0 и тяхната положителна Грам реакция, отрицателна каталазна реакция и формата на пръчката (данните не са показани). Устойчивостта на ниско рН е важен критерий за избор на пробиотични микроорганизми, тъй като стомашният сок в стомаха унищожава повечето погълнати микроорганизми. Бърнс и сътр. [17] и Jamaly et al. [18] също така документира, че всички тествани щамове са били в състояние да понасят три часа излагане на киселина при pH 2.0 с бавно намаляване на жизнеспособността. Много други проучвания потвърждават, че излагането на щамове Lactobacillus на стойности на pH от 2,5-4,0 не влияе върху степента на тяхното оцеляване, но е спаднало при по-ниски стойности на pH [19-21]. Съобщава се, че способността на flactobacillito да преживява преминаването през среда с физиологично рН от 2,0 до 3,0 (да имитира стомашната среда) е променлива и зависи от щама, но със степен на оцеляване от приблизително 85%, което е много важно за пробиотичното поле [22, 23].

Всички изолати бяха оценени за тяхната инхибиторна активност спрямо избрани Грам-положителни и Грам-отрицателни бактерии. В теста с агар на място, изолатите на Lactobacillus демонстрират различни инхибиторни активности, когато се тестват срещу индикаторни щамове, докато зоната на инхибиране варира от 1 mm до 5 mm (таблица 1). 93% от изолатите на Lactobacillus проявяват антимикробна активност срещу L. monocytogenes. S. lentus и E.faecalis бяха инхибирани съответно от 82% и 80%. 86% от изолатите показват антимикробна активност срещу S. aureus и 79% срещу S. epidermidis. Много от щамовете (93%) показват инхибиторна активност срещу S. enterica. S. paucimobilis е инхибиран при 68% от щамовете. Само 52% от изолатите на Lactobacillus проявяват активност срещу A. calcoaceticus.

Установено е, че общо 26 изолати произвеждат силни зони на инхибиране (зона на инхибиране от повече от 2 mm до 5 mm)

Таблица 1: Брой прогнозни изолати на лактобацили с антимикробен ефект срещу индикаторни щамове.