Информация за статия

Мерике Вахер, Катедра по химия и биотехнологии, Технически университет в Талин, Академия тройка 15, 12618, Талин, Естония; [имейл защитен]

иридоидната

Резюме

През вековете билковите екстракти са били широко използвани в народната медицина за лечение на различни заболявания, докато съвременните фитохимични и фармакологични изследвания са предоставили допълнителни знания за използването на лечебни растения. Родът Дипсак включва 15 вида, разпространени в цяла Европа, Западна Азия и Северна Африка, 1 и са популярни билкови лекарства, използвани в народната медицина. От Дипсак видове, D. asper и D. аспероиди корените и семената са изследвани най-задълбочено. Те отдавна се използват за лечение на болки в кръста, травматичен хематом, костни фрактури и възпаление. 2 -5 Екстракти, както и изолати, от избрани Дипсак Доказано е, че видовете проявяват различни биоактивности, включително невропротективни, 6 антиостеопоротични, 7 антиоксидантни, 2 антикомплементарни, 8 и антибактериални. Освен това се съобщава, че тези видове имат терапевтичен ефект при алергична астма 10 и различни кожни заболявания. 11 -15 Неотдавнашно проучване разкри десетки биоактивни съединения в Дипсак видове, включително тритерпеноиди, тритерпеноидни сапонини, иридоидни гликозиди, фенолни киселини и алкалоиди. 16.

Въпреки факта, че Дипсак има дълга народна история за лечение на рак, 13 данни за неговата цитотоксична и противотуморна активност са оскъдни. Има само няколко статии за антипролиферативните дейности на целия му екстракт от корени, 17 и изолираните активни съединения, като водоразтворим полизахарид (MW 16 kDa), 18 индол алкалоиди, 19 и сапонини. 9,20 -22

Иридоидите, друг вид биоактивни съединения от растителен произход, представляват голяма група циклопентано [c] пиран монотерпеноиди, биосинтезирани от изопрен. Тези иридоиди и техните гликозиди са съставни части на голям брой растителни семейства, включително Дипсак видове. Гореспоменатите съединения имат биогенетично и хемотаксономично значение, тъй като осигуряват структурна връзка между терпени и алкалоиди. Редица изследователи съобщават за значителна антитуморна активност на иридоидните гликозиди. 23 -28

Към днешна дата са изолирани около 30 иридоида D. asper, D. laciniatus, D. фулонум, D. japonicus, и D. ferox, 16,29, но техният цитотоксичен ефект е оценен само от няколко изследователи. Широкото разпространение и забележителните фармакологични дейности на Дипсак видовете показват техния потенциал за откриване и разработване на нови природни лекарства. Преди това екстрактите от листата и корените на D. фулонум са изследвани само за инхибиране на α-амилаза, 32 докато описанията на нейните терапевтични свойства най-често могат да бъдат намерени в енциклопедии. 12,15 Приложимостта на D. фулонум за лечение на рак в народната медицина е споменато в някои публикации. 13,14

Това проучване изследва вторичните метаболити на D. фулонум листа с цел търсене на съединения с противоракова активност. Следователно, иридоидната гликозидна фракция на метанолния екстракт се характеризира и се установява неговата in vitro цитотоксичност срещу миши фибробласт NIH/3T3, меланомен миши B16F10, HeLa човешки рак на маточната шийка и човешки рак на гърдата MCF7 и MDB-MB-231 клетки.

Резултати и дискусия

Разделяне и идентифициране на бис-иридоидната гликозидна фракция

За качествена оценка всички събрани фракции се анализират чрез тънкослойна хроматография (TLC), като се използва UV облъчване при 254 и 312 nm, за да се визуализира присъствието на съединенията от интерес. Дължината на вълната на облъчване от 312 nm се използва за селекция на иридоидната гликозидна фракция, като се елиминира хлорофилната лента, за която е известно, че притежава противораков ефект. 33 Въз основа на резултатите от TLC, фракции, съдържащи петна със същия задържащ фактор, се комбинират в 1 фракция, концентрират се и се анализират чрез високоефективна течна хроматография-детектор-масова спектрометрия с диодна решетка (HPLC-DAD-MS). Анализът показа, че иридоидите присъстват във фракции 9-27. За по-нататъшни експерименти обаче е избрана комбинираната иридоидна фракция 9-11, която е най-свободната от допълнителни компоненти, включително хлорофил.

Вторият основен пик, получен за фракция 9-11 (съединение 2) е идентифициран като силвестрозид III– (IV) диетилацетал, с молекулна формула C31H46O15 и моноизотопна молекулна маса 658.2837 Da. HRMS анализът разкрива появата на депротониран йон при m/z 657,2746 (изчислено като m/z 657.2759). Фрагментацията на псевдомолекулния йон произвежда 2 родителски йона при m/z 625.2487 (изчислено като m/z 625.2493) и m/z 447.1853 (изчислено като m/z 447.1866), които съответстват на загубата на метокси групата (-32 Da) и иридоида (-120 Da), съответно. Спектралната линия при m/z 267.1224 (изчислено като m/z 267.1233) принадлежат на молекулярния фрагмент, който губи иридоид (-120 Da), глюкозид (-162 Da) и вода (-18 Da). Най-вероятно това съединение няма естествен произход и се образува по време на реакцията на ацетализация по време на обработката на фракцията с етанол и следователно трябва да се счита за артефакт.

Тест за цитотоксичност

Фигура 1 Количественото определяне на мъртвите клетки след 72 часа инкубация с иридоидната гликозидна фракция. Резултатите за оценка на поглъщането на PI за 72 часа са показани в (A) и (B). Резултатите с 1: 5-кратно разредена фракция са показани в (А), цитотоксичността на неразредената фракция е показана в (В). (A) и (B) показват средното ± стандартното отклонение; бяха извършени поне 3 независими експеримента в 3 паралела; *P

Въз основа на резултатите от анализа на PI, цитотоксичността на неразредената иридоидна гликозидна фракция е оценена чрез теста WST-1 само след 72 часа инкубация. Резултатите показват, че фракцията предизвиква статистически значимо намаление (P Фигура 2), докато токсичността към неракови NIH 3T3 клетки е ниска, 92,8% ± 0,5%, спрямо контролата. Клетките HeLa също демонстрират статистически значима чувствителност към токсичността на иридоидната гликозидна фракция (78,9% ± 4,7%), което може да се отдаде на ранните промени в метаболитните дейности на клетките, докато PI анализът все още не показва увеличаване на броя на мъртвите клетки.

Фигура 2 Резултатите от теста за жизнеспособност на WST-1 на неразредената фракция за 72 часа за различни клетъчни линии. Фигурата показва средната стойност ± стандартно отклонение; бяха извършени поне 3 независими експеримента в 3 паралела; **P

Наскоро ацилирани иридоиди от Premna odorata (Lamiaceae) са показали, че имат силна антипролиферативна активност срещу различни клетъчни линии на рак на гърдата, включително MCF 7 и MDB-MB-231, в зависимост от експресията на ERα и c-Met в клетъчната линия. 35 В настоящото проучване изследователите демонстрират, че немодифицирани иридоидни гликозиди, изолирани от D. фулонум листа упражняват селективен цитотоксичен ефект върху същите туморни клетъчни линии, докато нормалната клетъчна линия NIH3T3 е много по-малко засегната.

Заключения

В настоящото проучване бис-иридоидната гликозидна фракция от екстракта на D. фулонум листа се отделя и характеризира. HPLC-MS анализи показват, че фракцията се състои главно от бис-иридоиди. Резултатите от проучването показват, че иридоидите упражняват селективен цитотоксичен ефект върху различни ракови клетки, докато не се наблюдава такъв ефект върху нормалните клетки. Тестът WST-1 установява значителна чувствителност на клетки MCF7 и MDB-MD-231 към иридоидните гликозиди от D. фулонум екстракти от листа. Анализът WST-1 също дава доказателства за намаляване на митохондриалната функция, докато PI открива повишен брой мъртви клетки. По-нататъшно проучване ще бъде необходимо за по-задълбочено разбиране на молекулярния механизъм на иридоидите против рак на гърдата.

Експериментално

Материали

Всички реагенти са с аналитично качество и са използвани както са получени. Хлороформ, н-бутанол, ацетонитрил, мравчена киселина (FA), PI и фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) са закупени от Sigma & Aldrich (Германия). Метанол и етанол (EtOH) са закупени от Fluka (Швейцария). За приготвянето на всички разтвори е използвана дейонизирана вода (Milli Q, Millipore S AS, Molsheim, Франция).

Екстракция

Листата на Dipsacus fullonum, събрани в Сааремаа, Естония, през юни-август 2017 г., бяха измити с вода Milli Q, изсушени при стайна температура и прахообразни в механична мелница.

Идентификацията на растенията е извършена чрез сравнение с автентичен екземпляр Dipsacus fullonum, а ваучерният екземпляр е депозиран в Хербариума на Института по земеделски и екологични науки на Естонския университет на науките за живота (TAA), хербарни образци TAA0153271-TAA0153274.

Условията и разтворителят за екстракция са избрани съгласно предварително публикувано проучване. 36 Десет грама сушени на въздух прахообразни листа от D. фулонум се накисва в 200 ml 80% метанол в затворена бутилка при стайна температура за 1 час и се екстрахира с ултразвукова баня при 40 ° С за 30 минути. Смесите се центрофугират при 8000 rpm в продължение на 10 минути и се филтруват през 0,45 µm целулозен филтър. Аликвотна част беше подложена на предварителен идентификационен анализ. Основната част от екстракта се изпарява до сухо в ротационен изпарител и след това се претегля.

Изолиране на сместа от иридоидни гликозиди

Сухият суров екстракт от D. фулонум се подлага на колонна хроматография, като се използва стъклена колона (15 cm × 2.5 cm), напълнена със суспензия от силикагел (40, 100 цт) в хлороформ, при съотношение на суров екстракт/силикагел 1:20. Използва се метод за сухо зареждане на суровия екстракт. За това определено количество суров екстракт се разтваря в метанол и се адсорбира в малко количество силикагел, изсушава се с помощта на ротационен изпарител и се нанася върху колоната. Колоната се елуира, използвайки техника на елуиране със стъпков градиент от хлороформ до метанол.

Колоната се развива чрез добавяне на 10 ml от всеки елуент, като се събират 3 ml фракции; фракциите се оценяват чрез TLC, като се използва подвижна фаза вода: етанол:н-бутанол (1: 1: 4). Събрани са общо 54 фракции. Фракциите с еднакви петна и същите фактори на задържане се комбинират в 1 фракция. Фракцията на иридоидните гликозиди се изпарява до сухо. След изсушаване 5 mg от твърдия остатък се разтварят в 500 µL етанол и се подлагат на HPLC-MS анализ.

Хроматографски анализ

Хроматографското разделяне се извършва на спектрометър Agilent Technologies 6540 UHD с точна маса Q-TOF LC/MS, оборудван с детектор с диодна решетка и йонизационен източник AJ-ESI (Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Оптималното разделяне се получава на колона Eclipse Plus C18 (150 × 2,1 mm, 3,5 µm; Agilent Technologies, САЩ), с подвижна фаза, състояща се от 0,1% воден FA и ацетонитрил (съдържащ 0,1% FA). HPLC разделянето се извършва, като се използва метод на непрекъснато градиентно елуиране. Програмата за градиент беше, както следва: 0 минути — 0% В, 20 минути - 50% В, 25 минути - 95% В, изократична за 5 минути. След това системата беше уравновесена за 5 минути. Дължината на вълната на детекция, скоростта на потока, температурата на колоната и обемът на инжектиране бяха зададени съответно на 254 nm, 0.6 mL/min, 20 ° C и 5 uL. Параметрите за MS анализ бяха зададени в режим на отрицателни йони, като спектрите бяха получени в диапазон на масата от 100 до 1000 m/z. Азотът се използва за пулверизиране и за изсушаване на газа, а хелий се използва като газ за сблъсък. Идентифицирането на пик беше постигнато чрез анализ на MS 2.

Клетъчни култури

Миши фибробласт NIH/3T3, миши меланом B16F10, HeLa човешки ракови клетки на маточната шийка, човешки рак на гърдата MCF7 и MDB-MB-231 клетъчни линии са получени от American Type Culture Collection. Клетките се размножават в модифицирана среда на Dulbecco на Eagle’s (DMEM) (Gibco), допълнена с 10% говежди телешки серум (Gibco) и 5% пеницилин/стрептомицин. Всички клетъчни линии бяха инкубирани при 37 ° С във овлажнена 5% СО2 и 95% въздушна атмосфера.

Процедури за лечение и подготовка на пробите

Клетките се посяват с плътност 2,5 × 105 клетки/ямка (The Countess Automated Cell Counter, Invitrogen) в 96-ямкови плаки и се инкубират за една нощ. След 24 часа инкубация се добавят 100 µL или прясна среда, или прясна среда, съдържаща бис-иридоидната фракция (1 µL, разредена при 1: 5 с EtOH бис-иридоидна фракция, или 1 µL от неразредената бис-иридоидна фракция) във всяка ямка и се инкубира за още 48 и 72 часа.

PI анализ

PI е червено-флуоресцентно ДНК-свързващо багрило, което се използва за откриване на нежизнеспособни клетки с нарушени клетъчни мембрани, тъй като не може да премине през непокътнати клетъчни мембрани. Към 100 uL клетъчна култура се прибавят 0.5 mM PI в PBS при 0.5 uL/​​ямка и се инкубират в продължение на 10 минути при 37 ° С. Клетките, с добавка на 1 µL 96% EtOH, бяха използвани като отрицателна контрола и тяхната PI флуоресценция беше отчетена като 1. Интензивността на флуоресценцията беше измерена с помощта на TECAN Genios Pro Microplate Reader (възбуждане 540 nm, емисия 612 nm) на 48 и 72 часа след третирането с екстрактите. Нормализираните резултати представляват увеличение на гънките от контролните островчета.

Клетъчна жизнеспособност, измерена чрез WST-1

Ефектът на екстрактите върху жизнеспособността на клетките се определя, като се използва анализ на жизнеспособността на клетките WST-1 (Roche). WST-1 позволява колориметрично измерване на жизнеспособността на клетките, поради намаляването на тетразолиевите соли до водоразтворим формазан от жизнеспособни клетки. Количеството на образувания багрил формазан корелира с броя на жизнеспособните клетки. Измерванията бяха завършени 72 часа след обработката на клетките. Експериментите, с добавяне на 1 uL 96% EtOH, бяха използвани като отрицателна контрола. Пет микролитра на гнездо от реагент WST-1 се добавят към 100 µL от клетъчната културна среда, инкубира се при 37 ° С в продължение на 2 часа, след което абсорбцията се измерва при 450 nm с помощта на четец за микроплаки TECAN Genios Pro.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ, заедно с post hoc теста за множество сравнения на Dunnett. Графиките представят данни от поне 3 независими експеримента, всички извършени в три екземпляра, като средно ± стандартно отклонение. В анализа на жизнеспособността на клетките положителните клетки се нормализират до 100% в отрицателната контрола. В анализа на PI резултатите представят увеличението на гънките от контролните островчета. Статистическа значимост на P

Декларация за конфликт на интереси
Авторът (ите) не декларира потенциален конфликт на интереси по отношение на изследванията, авторството и/или публикуването на тази статия.

Финансиране
Авторът (ите) разкрива получаването на следната финансова подкрепа за изследването, авторството и/или публикуването на тази статия: Това изследване е подкрепено от Естонския изследователски съвет (Институционален изследователски фонд № 33-20).