Affiliation Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Aberdeen, Великобритания

диета

Affiliation Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Aberdeen, Великобритания

Affiliation Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Aberdeen, Великобритания

Отделение по физиология на животните, Биологически факултет, Университет Филипс Марбург, Марбург, Германия

Affiliation Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Aberdeen, Великобритания

Affiliation Rowett Institute of Nutrition and Health, University of Aberdeen, Aberdeen, Великобритания

Програма за изследване на опорно-двигателния апарат, Институт по медицински науки, Университет в Абърдийн, Абърдийн, Великобритания

Отдел по храните, водата и козметиката, Отдел по екологична медицина, Норвежки институт за обществено здраве, Осло, Норвегия

Отдел по храните, водата и козметиката, Отдел по екологична медицина, Норвежки институт за обществено здраве, Осло, Норвегия

Програма за изследване на опорно-двигателния апарат, Институт по медицински науки, Университет в Абърдийн, Абърдийн, Великобритания

Отделение по физиология на животните, Биологически факултет, Университет Филипс, Марбург, Марбург, Германия

  • Линда М. Уилямс,
  • Фиона М. Кембъл,
  • Джанис Е. Дрю,
  • Кристиане Кох,
  • Найджъл Хогард,
  • Уилям Д. Рийс,
  • Торкамол Камолрат,
  • Ха Тхи Нго,
  • Ингер-Лизе Стефенсен,
  • Стюарт Р. Грей

Фигури

Резюме

Цитат: Williams LM, Campbell FM, Drew JE, Koch C, Hoggard N, Rees WD, et al. (2014) Развитието на диета, предизвикано от затлъстяване и непоносимост към глюкоза при мишки C57Bl/6 при диета с високо съдържание на мазнини, се състои от различни фази. PLoS ONE 9 (8): e106159. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0106159

Редактор: Майкъл Мюлер, Университет на Източна Англия, Великобритания

Получено: 7 март 2014 г .; Прието: 19 юни 2014 г .; Публикувано: 29 август 2014 г.

Наличност на данни: Авторите потвърждават, че всички данни, лежащи в основата на констатациите, са напълно достъпни без ограничения. Данните са качени в Figshare и са достъпни под DOI: http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1093830.

Финансиране: LMW, FMC, JED, CG, GH, ACM, PN, AJF, NH, WDR, SMH са финансирани от отдела за научни и аналитични услуги в областта на селските райони и околната среда (RESAS) на шотландското правителство. AT и KC са финансирани от германското министерство на научните изследвания и образованието (Реф. №: 0315087), HTN и I-LS са финансирани от Изследователския съвет на Норвегия (проект № 196112/H10. Финансиращите не са имали роля в дизайна на проучванията, събиране и анализ на данни, решение за публикуване или подготовка на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Затлъстяването и свързаните с него метаболитни нарушения до голяма степен са резултат от прекомерното потребление на енергийно гъсти храни, богати на захар и наситени мазнини с дълга верига. Индуцираното от диетата затлъстяване води до нечувствителност към инсулин и многобройни проучвания показват, че затлъстяването и нечувствителността към инсулин са свързани с наличието на нискостепенно възпаление [1], [2]. Допълнителни доказателства за ролята на възпалението при затлъстяването идват от проучвания, при които възпалението или се инхибира, което води до предотвратяване на нечувствителност към инсулин и намаляване на наддаването на тегло [3] - [5], или инхибиране на противовъзпалителните пътища, което увеличава наддаването на тегло и развитието на метаболитния синдром [6]. Въпреки че е добре установено, че наситените с диети наситени мастни киселини причиняват инсулинова нечувствителност и затлъстяване [7], има известен дебат относно ролята на индуцираното от липидите повишаване на пропускливостта на червата и последващо изтичане на чревен бактериален липополизахарид (LPS) [8], за разлика от ролята на липидното претоварване и извънматочното отлагане на мазнини [9], [10] при възпаление, свързано със затлъстяването.

Методи

Декларация за етика

Всички проучвания, включващи животни, са лицензирани съгласно Закона за животните (научни процедури) от 1986 г. и са получили одобрение от Комитета по етичен преглед на Института по хранене и здраве на Rowett.

Животни

Глюкозна толерантност

Проведени са интраперитонеални тестове за глюкозен толеранс (IPGTTs) (n = 6–8) като невъзстановителна процедура след гладуване в продължение на 5 часа. Взема се кръвна проба (0 минути) преди интраперитонеалната IP инжекция с глюкоза (1,5 mg/g телесно тегло). Последващи кръвни проби бяха взети от опашната вена на 15, 30, 60 и 120 минути и измервани с помощта на монитор за кръвна захар Accu chek Aviva (Roche Diagnostics, Burgess Hill, UK). Площта под кривата (AUC) е изчислена с помощта на правилото за трапец [23].

Имунохистохимия

Отделна група животни бяха убити чрез сърдечна пункция под терминална анестезия, индуцирана от Euthatal (натриев фенобарбитал) при концентрация от 500 mg/Kg инжектиран IP. Чернодробната, епидидималната WAT и мускулите на гастрокнемия са фиксирани в 4% параформалдехид за имунохистохимия и/или маслено червено O оцветяване (n = 6-8). Тъканите бяха замразени и криосекциите бяха нарязани за оцветяване с маслено червено. За имунохистохимия тъканите бяха вградени с восък, срезовете бяха изрязани и обезпарафинирани преди оцветяване с анти-мише F4/80 антитяло на плъх (AbD Serotec, Kidlington, UK). По-нататъшни стъпки бяха извършени с помощта на Vectastain Elite ABC Kit в съответствие с инструкциите на производителя (Vector Laboratories, Peterborough, UK). Анализът на микроскопските изображения беше извършен с помощта на система Image Pro-plus (Media Cybernetics, Silver Springs, MD, USA).

PCR анализи в реално време

Тъканите бяха замразени в течен азот за PCR в реално време. Общата РНК се извлича от черен дроб, WAT и илеум, като се използва RNeasy Mini Kit (Qiagen, Crawley, UK), включващ DNase смилане. Общата РНК беше изолирана от мускулите на гастрокнемия, използвайки реагент TRIzol (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, CA, US). Екстрахираната обща РНК се определя количествено с помощта на NanoDrop спектрофотометър (NanoDrop Technologies). Качеството се оценява с помощта на Agilent Bioanalyser (Agilent Technologies).

За оценка на генната експресия в мускулите на гастрокнемиус TaqMan сондите са проектирани от Universal ProbeLibrary, ProbeFinder версия 2.45 за мишка (Universal ProbeLibrary, Roche). Праймерните последователности бяха; GAPDH напред 5′-CCTTGAGATCAACACGTACCAG-3 ′, реверс; 5′-CGCCTGTACACTCCACCAC-3 ′; TNF-α напред 5′-CTGTAGCCCACGTCGTAGC-3 ′, обратен 5′-TTGAGATCCATGCCGTTG-3 ′; IL-6 напред 5′-GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA- 3 ′, заден 5′-CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA-3 ′; IL-1β напред 5′- TGTAATGAAAGACGGCACACC-3 ′, обратен 5′- TCTTCTTTGGGTATTGCTTGG-3 ′; и бяха закупени от Sigma-Aldrich (Gillingham, Dorset, UK), Реакциите бяха проведени с използване на 10 µl LightCycler 480 Probes MasterMix в съответствие с инструкциите на производителя. PCR анализите в реално време се провеждат с помощта на системата LightCycler 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия). Програмата за колоездене се състои от предварителна инкубация от 10 минути при 95 ° C, последвана от 45 цикъла, състоящи се от 10 секунди при 95 ° C и 30 секунди при 60 ° C. Числото Ct беше измерено с помощта на софтуера Lightcycler 480 версия 5 (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия).

Изчислени са нивата на транскрипт спрямо референтния ген, GAPDH в мускулите и илеума и B2M в черния дроб и WAT (ΔCt). Промени в експресията на сгъване между експериментални групи по отношение на GAPDH или B2M се изчисляват от стойностите на ΔΔCt (n = 6-8). Тъй като тези стойности са съотношения, няма стандартни грешки.

Двуизмерна гел електрофореза (2-DE)

2-DE беше извършен по същество, както е описано по-рано, с някои модификации [24]. За разделяне на плазмените протеини в първото измерение бяха използвани ленти Bio-Rad, 11 cm, имобилизирани ленти с градиент на рН (IPG) (pH 3–10). Лентите бяха рехидратирани в буфер за рехидратация (7 M урея; 2 M тиокарбамид; 4% w/v CHAPS; 2% w/v Biolyte; и 50 mM DTT), съдържащи 200 µg протеинова проба в Bio-Rad IEF клетка и след това фокусирани.

След като IPG лентите от първо измерение бяха инкубирани в свеж буфер за уравновесяване (6 M урея; 2% w/v SDS; 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 20% v/v глицерол; и 130 mM DTT) в продължение на 10-15 минути при стайна температура преди прехвърляне във втори уравновесяващ буфер (6 M урея; 2% w/v SDS; 0,375 M Tris-HCl, pH 8,8; 20% v/v глицерол; и 135 mM йодоацетамид) за 10-15 минути в стаята температура. След това лентата беше приложена върху горната част на предварително сглобена касета с гел Criterion XT Bis-Tris 3–12% IPG + 1 гнездо и 5 µl от всички стандарти за сини прецизни протеини (Bio-Rad) бяха заредени в референтната ямка. Геловете се пускат при 200 V, докато бромофеноловото синьо не достигне дъното на гела. Геловете бяха фиксирани и оцветени с Coomassie Blue (n = 5).

Идентифициране на миши плазмени протеини

2-DE геловете бяха анализирани с помощта на софтуера Progenisis Samespots (Nonlinear Dynamics Ltd, Великобритания). Петна, които показват разлики в нормализирания среден обем с P Фигура 1.

A. Телесното тегло на HF хранени мишки се различава значително от това на LF хранени мишки след 3-дневно хранене (P Фигура 2.

A, B & C. Чернодробни липиди, измерени чрез анализ на изображение на маслено червено O в произволни единици (AU). A. оцветяването нараства линейно с времето на диета при HF хранени мишки от 1 седмица (P Фигура 3.

A. Плазменият триацилглицерол (TAG) е значително по-нисък при HF хранени мишки както на 3 дни, така и на 1 седмица на диета (Р Фигура 4.

A – D. Интраперитонеални тестове за толерантност към глюкоза (IPGTT) при LF хранени мишки •, HF хранени мишки • и PF хранени мишки ▪, хранени с HF диета, ограничена до калорийния прием на LF хранени мишки, след 3 дни, 1, 12 и 16 седмици след начало на диетата. IPGTT се провежда като процедура без възстановяване, тъй като ефектът от гладуването и администрирането на глюкоза може да промени генната експресия за известно време след това. (n = 6–8). Е. Сравнението на% разлика в общата AUC между LF и HF мишки с течение на времето, използвайки двупосочен ANOVA, показа, че когато са включени времеви точки 3 дни и 16 седмици, диетата и времето имат значителен ефект върху глюкозния толеранс (F1,58 = 94,56, P Фигура 5.

A. Нивата на плазмен лептин са значително по-високи при HF хранени мишки след 3 дни на диета (P Фигура 6. Представителен 2D Coomassie оцветен гел от миша плазма след 3 дни на HF диета. Bio-Rad, 11 cm, имобилизирани ленти с градиент на рН (IPG) (pH 3–10) са използвани за разделяне на плазмените протеини в първото измерение.

След първото измерение IPG лентата беше приложена върху горната част на предварително сглобена касета с гел Criterion XT Bis-Tris 3–12% IPG + 1 гнездо и 5 µl от всички стандарти за прецизен син протеин (Bio-Rad) бяха заредени в референтната ямка. Геловете бяха фиксирани и оцветени с Coomassie Blue. Номерираните петна показват тези със значително различни средни нормализирани обеми (P Фигура 7.

A. Нива на плазмен протеин на хаптоглобин (P Таблица 1. Идентификация на протеини чрез LC/MS/MS на петна в 2DE гелове на 3-дневни мишки, които са значително различни в средния нормализиран обем в HF в сравнение с LF хранени мишки (n = 5).

Възпалителни маркери в плазмата

Плазмените нива на IL-6 бяха повишени при HF хранени мишки след 3 дни на диета (Р Фигура 8.

A. Плазмените нива на IL-6 бяха повишени след 3 дни на високочестотна диета (P Фигура 9.

A. Експресията на ген на SerpinA3N в черния дроб беше значително регулирана в HF диета през цялото време на изпитване 3 дни (P Фигура 10.

A. Площта на F4/80 оцветяване в черния дроб, измерена като произволни единици (AU) е значително увеличена при HF хранени мишки през всички тествани точки от време (P Фигура 11.

A. Експресията на IL-1β ген в мускулите е непроменена след 3 дни HF диета, но е регулирана нагоре на 12 седмица (P Фигура 12.