Допринесе еднакво за тази работа със: Шу-Пинг Фу, Хао Хонг

целия

Разследване на роли, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

‡ ‡ Тези автори са първи автори на тази работа.

Ключова лаборатория за акупунктура и медицински изследвания към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Допринесе еднакво за тази работа със: Шу-Пинг Фу, Хао Хонг

Роли Администриране на проекти, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

‡ ‡ Тези автори са първи автори на тази работа.

Ключова лаборатория за акупунктура и медицински изследвания към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Ключова лаборатория за акупунктура и изследвания на медицината към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Роли Куриране на данни

Партньорско училище по информационни технологии, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Роли Куриране на данни

Ключова лаборатория за акупунктура и изследвания на медицината към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Ключова лаборатория за акупунктура и изследвания на медицината към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Ключова лаборатория за акупунктура и медицински изследвания към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Роли Администрация на проекта

Ключова лаборатория за акупунктура и медицински изследвания към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Роли Администрация на проекта

Ключова лаборатория за акупунктура и медицински изследвания към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Роли Администрация на проекта

Ключова лаборатория за акупунктура и медицински изследвания към Министерството на образованието, Университет по китайска медицина в Нанкин, Нанкин, Китай

Свързана лаборатория по генетика и физиология, Национален институт по диабет, храносмилателни и бъбречни заболявания, Национални здравни институти, Бетесда, MD, Съединени американски щати

Концептуализация на роли, придобиване на финансиране, надзор, писане - преглед и редактиране

Изследователски център за регенеративна медицина на партньорство, Западнокитайска болница, Съчуански университет, Ченгду, Съчуан, Китай

  • Шу-пинг Фу,
  • Хао Хонг,
  • Шън-Фън Лу,
  • Чен-Джун Ху,
  • Hou-Xi Xu,
  • Цян Ли,
  • Мей-Линг Ю,
  • Chen Ou,
  • Jian-Zhong Meng,
  • Тиан-Лин Уанг

Фигури

Резюме

Съобщава се, че акупунктурата е ефективна при лечението на заболявания, свързани със затлъстяването, но механизмът й все още не е ясен. За да изследваме този механизъм, приложихме електро-акупунктура (EA) в миши модел на затлъстяване и използвахме RNA-seq за идентифициране на молекулярни последици. Изтриването на транскрипционния фактор STAT5 от невроните (Stat5NKO) доведе до затлъстяване. Акупунктурата от своя страна намалява телесното тегло и съотношението на епидидимална бяла мастна тъкан (Epi-WAT) към телесното тегло, а също така намалява плазмените концентрации на глюкоза, триглицериди и холестерол. В допълнение, EA повишава студената издръжливост на затлъстелите мишки Stat5NKO. EA обърна променената генна експресия в хипоталамуса и Epi-WAT, особено в хипоталамуса при мишки със затлъстяване Stat5NKO. Това проучване за първи път дава представа за геномните мрежи на затлъстяването и тяхната модулация чрез електро-акупунктура, което от своя страна разкрива потенциални механизми, които обясняват индуцираната от акупунктурата загуба на тегло.

Цитат: Fu S-P, Hong H, Lu S-F, Hu C-J, Xu H-X, Li Q, et al. (2017) Регулиране на електроакупунктурата в целия геном върху невронните мишки със затлъстяване, предизвикани от загуба на Stat5. PLoS ONE 12 (8): e0181948. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181948

Редактор: Йоханес Флекенщайн, Университет в Берн, ШВЕЙЦАРИЯ

Получено: 27 октомври 2016 г .; Прието: 10 юли 2017 г .; Публикувано: 14 август 2017 г.

Това е статия с отворен достъп, без никакви авторски права, и може да бъде възпроизвеждана, разпространявана, предавана, модифицирана, надграждана или използвана по друг начин от всеки за каквато и да е законна цел. Произведението е предоставено на базата на Creative Commons CC0, посветена на публичното достояние.

Наличност на данни: Суровите RNA-seq данни са депозирани в базата данни на GEO в NCBI под номера за присъединяване GSE100599.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Националната фондация за естествени науки на Китай (No. 81574063, 81403479, 81273838), Фондация за естествени науки на провинция Дзянсу в Китай (No. BK20130956).

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Затлъстяването се характеризира с натрупване на мазнини в резултат на излишен енергиен прием и недостатъчен разход на енергия, което води до необичайно прекомерно съхранение на триглицериди в мастната тъкан. Той се счита за един от най-рисковите фактори за диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания, хипертония, рак и повишена заболеваемост и смъртност [1–4]. Епидемията от затлъстяване нараства в продължение на четири десетилетия, а броят на затлъстелите индивиди се очаква да достигне 1,12 милиарда до 2030 г. [5,6]. Повечето от настоящите лекарства и терапии срещу затлъстяване обаче не успяват да постигнат адекватен контрол на теглото при пациенти поради странични ефекти като промени в настроението, мисли за самоубийство и стомашно-чревни и сърдечно-съдови усложнения [7].

Генетичните изследвания на човешкото затлъстяване показват, че при редките моногенни форми на затлъстяване всички мутации се намират в централната нервна система (ЦНС), която регулира енергийната хомеостаза на тялото [17,18]. STAT5 е един от най-безразборните членове на сигналните преобразуватели и активаторите на семейството транскрипция (STATs); силно се изразява в различни популации на хипоталамусните неврони [19]. STAT5 е докладван като жизненоважен фактор за адипогенезата и затлъстяването. Той се фосфорилира на мястото си на тирозин по време на процеса на адипогенеза, след което се премества в ядрото, за да активира генни експресии надолу по веригата [20,21]. Съставно активният STAT5 може да замести хормона на растежа, за да насърчи адипогенезата на преадипоцитите, но неговите антисенс олигонуклеотиди могат да отслабят този ефект [22,23]. Нашето предишно изследване in vivo установи, че както мъжки, така и женски мутантни мишки, чиито локуси Stat5a/b в ЦНС са били изтрити (Stat5NKO), развиват тежко затлъстяване, придружено от хиперфагия, хиперлептинемия, нарушен термичен отговор на студа и инсулинова резистентност [24 ]. Но как централното STAT5 сигнализиране регулира апетита, термогенезата, както и периферния липиден профил и адипогенезата, остава неясно.

Следвайки предишните резултати от изследването, ние изследвахме потенциалната роля на централния Stat5 в акупунктурното лечение при затлъстяване в това проучване. Първо, ние приложихме акупунктурно лечение на затлъстели мишки Stat5NKO, в акупунктурни точки ST36 и ST44, за да оценим ефективността на акупунктурата. Второ, използвахме РНК секвениране (RNA-seq), за да генерираме профили на генна експресия в бялата мастна тъкан и хипоталамуса на затлъстелите мишки Stat5NKO с или без акупунктурно лечение, за да изследваме характеристиките на генната експресия при тези мишки и диференциално експресирани гени (DEG) поради акупунктура. Нашите данни показват, че STAT5 в ЦНС играе различни роли в хипоталамуса и белите мастни тъкани по време на генни транскрипционни дейности и че акупунктурата може да регулира голямо количество DEG спрямо нормалните им нива на експресия, особено в хипоталамуса. По този начин ефектът на загуба на тегло от акупунктурата може да се отдаде на нейните функционални механизми за регулиране на гените.

Материали и методи

Животни и групиране

Централни специфични Stat5-изтрити мишки (Stat5NKO мишки) са генерирани, както е описано по-рано (Yongzhi Cui; 2004). Накратко кръстосахме мишки, носещи Cre рекомбиназа, експресирана под контрола на промотора на Nestin (Nestin-Cre) (подарък от д-р Хановер от NIH, САЩ) с мишки, приютяващи алели Stat5a/b, фланкирани с LoxP (мишки Stat5fl/fl) (предоставени от д-р Hennighausen от NIH, САЩ). Мишките Stat5fl/fl и Stat5NKO бяха настанени при 23 ± 1 ° C в 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до вода и храна за чау. Western blot беше използван за потвърждаване на ефективността на делеция на мишките Stat5NKO (S1 Фиг.). 12-седмични мишки Stat5NKO с телесно тегло с 20% по-тежко от това на мишки Stat5fl/fl бяха избрани като затлъстели мишки и бяха разделени на група Stat5NKO, група Stat5NKO + EA, същите седмици на възраст Stat5fl/fl мишки бяха разделени на Stat5fl/fl група и Stat5fl/fl + EA група, всяка група има 10 мишки. Телесното тегло и консумацията на храна във всички групи се отчитат веднъж седмично. Това проучване беше одобрено от Институционалния комитет по грижа и употреба на животните към Университета по китайска медицина в Нанкин и всички процедури бяха проведени в съответствие с насоките на Националния комитет по здравеопазване и грижа за животните.

EA намеса

Мишките бяха евтаназирани с интравенозни инжекции с високи дози пентобарбитон. Хипоталамусът и мастната тъкан, включително бялата мастна тъкан на епидидима (Epi-WAT), ингвиналната бяла мастна тъкан (Ing-WAT) и кафявата мастна тъкан (BAT), разположени в областта на лопатката на мишките, бяха разрязани, претеглени и незабавно щракнати -замразени в течен N2 и съхранявани при -80 ° C за допълнителен анализ.

Откриване на плазмени триглицериди, холестерол, LDL, лептин и глюкоза

Концентрации на циркулиращ триглицерид (TG), общ холестерол (TC), липопротеин с ниска плътност (LDL) (F001-1 за TG, F002-1 за холестерол, A113-1 за LDL; Jiancheng Institute of Biotechnology) и лептин (CRYSTAL CHEMINC, # 90030) бяха открити от ELISA в съответствие с препоръките на производителя. 40 μl стандарти или миши серум се добавят в 96 добре покрита плака с 10 μl маркирано с биотин антитяло и се инкубират при 37 ° С за 30 минути. След пет измивания реагентът HRP Conjugate се смесва за още 60 минути при 37 ° С. След това пробите се инкубират с разтвори на хромоген в продължение на 15 минути при 37 ° С. Стойностите на OD бяха открити при 450 nm с помощта на Multiskan FC (Thermo Scientific, САЩ) след добавяне на стоп разтвора. Нивата на TG, TC, LDL и лептин се определят количествено чрез стандартна крива. Концентрацията на глюкоза в плазмата е измерена с помощта на глюкомер (Johnson & Johnson Biological Devices, Китай) и тест ленти за глюкоза (One Touch Utra, партида: 3836186).

Хистологичен анализ

Тъканите бяха фиксирани в 4% параформалдехид и вградени с парафин. Оцветяването с хематоксилин и еозин (H&E оцветяване) се извършва, както е описано по-рано на 6-μm Epi-WAT секции. Изображенията за анализ са получени с помощта на светлинен микроскоп (Nikon, Япония). За анализ на диаметъра на адипоцитите бяха събрани пет изображения на животно с помощта на софтуера Image J (Национален институт по здравеопазване Bethesda, MD, САЩ). Ръчно обиколихме адипоцитите (повече от 250 клетки на животно) и измерихме диаметрите на адипоцитите [25].

Експеримент със студена издръжливост на мишки

За експерименти в студени стаи мишките все още бяха настанени поотделно и имаха свободен достъп до вода и храна (също се наблюдаваше теглото преди), ние също поставяме дебела подложка в клетката, за да се затоплят едновременно. Мишките се гладуват и се прехвърлят в студено помещение при 4 ° С за 24 часа. Телесните температури се наблюдават през различни интервали (0, 3h, 6h, 12h, 24h) през целия ден с ректална сонда чрез електро-термометър (TH212, Hongauchengyun, Китай).

RNA-seq и изчислителен анализ за RNA-seq данни

За да се разкрие потенциалната роля на централния STAT5 в развитието на затлъстяване, както и основния молекулен механизъм на лечението на ЕА при затлъстяване, RNA-seq за хипоталамуса и Epi-WAT бяха извършени с помощта на следващо поколение високопроизводително секвениране.

Общата РНК на хипоталамуса и Epi-WAT бяха изолирани, използвайки реагент Trizol® (Invitrogen, 15596018). Концентрацията на РНК се определя количествено чрез флуорометър Qubit® 2.0 (Invitrogen) с комплект за анализ на Qubit® RNA BR (Invitrogen, Q10211). Контролът на качеството на РНК (Agilent, 1309) се извършва с помощта на Agilent 2100 Bio-анализатор (Agilent Technologies, Inc. CA, USA) съгласно протоколите на производителя.

За RNA-seq, РНК библиотеката беше подготвена съгласно протокола TruSeq RNA Sample Preparation v2 (Illumina; 15025062), последвано от генериране на клъстери и секвениране с помощта на cBOT Multiplex рехибридизационна плака и TruSeq SBS комплект V3 (Illumina; 15021668). Секвенирането беше извършено с помощта на Illumina Hiseq 2000 (Illumina, САЩ). Анализът на данните беше извършен както беше описано по-горе. Суровите FASTQ файлове бяха извлечени от Illumina BCL с помощта на програмата Illumina CASAVA и след това подравнени към референтния геном на мишката (сглобка UCSC mm9) с помощта на програмата TopHat. Програмата Cufflinks беше използвана за сглобяване на отделни преписи, а програмата Cuffdiff беше приложена за анализ на експресия на диференциални преписи. Функционалната анотация и пътищата на гените бяха анализирани с помощта на DAVID Bioinformatics Resources [22]. Карта на топлината е генерирана от софтуера Cluster и TreeView. Гените с по-малко от един FPKM (средни фрагменти на килобаза от транскрипт на милион картографирани фрагменти) бяха филтрирани. Регулирането нагоре и регулирането надолу бяха определени като относително ниво на транскрипция над Log2 пъти промяна (FC) ≥ | ± 1 | и P стойност Фиг. 1. EA лечение възстановява Stat5NKO-индуциран затлъстял фенотип, подобрен енергиен метаболизъм и толерантност към студ при Stat5NKO затлъстели мишки.

(А) Наблюдение на телесното тегло в четирите групи, n = 10 във всяка група. (Б) Измерване на консумацията на храна, n = 10 във всяка група. (C) Съотношение на епидидимална и ингвинална бяла мастна тъкан, тегло на кафявата мастна тъкан към телесното тегло на мишката, n = 10 във всяка група. (D) Миши серумен лептин беше открит чрез ELISA, нивото на глюкозата беше измерено с помощта на глюкомер след 4-седмично електро-акупунктурно лечение, n = 10 във всяка група. (E & F) Лечението с EA намалява размера на адипоцитите на затлъстели мишки Stat5NKO. H&E оцветяване на Epi-WAT (E) заедно със средния диаметър на адипоцитите (F) в EA и мишки от контролната група, n = 5 във всяка група. (G) ЕА лечение намалява серумните нива на TG и TC на затлъстелите мишки Stat5NKO. Серумният холестерол (TC), триглицеридите (TG) и нивото на липопротеините с ниска плътност (LDL) бяха измерени чрез ELISA. n = 10 във всяка група. (Н) Лечението с ЕА повишава способността за студена издръжливост при мишките със затлъстяване Stat5NKO. Мишките се настаняват в студена стая с 4 ° С, ректалната температура се измерва след 3, 6, 12 и 24 часа; n = 6 във всяка група. * P # P ## P Таблица 1. Диференциално експресирани гени (DEG) с log2 (FC)> | ± 1 | и р стойност Фигура 2. GO анотация и анализ на пътищата на KEGG на регулирани нагоре или надолу гени в мишките Stat5NKO хипоталамус и Epi-WAT.

(A – F). (A) Резултати от анотирането на клетъчни компоненти на 388 регулирани нагоре гени в хипоталамуса на мишки Stat5NKO, показани в таблица 1. (B) Основни пътища на KEGG на 338 регулирани гена в хипоталамуса на мишки Stat5NKO, показани в таблица 1. (C) Клетъчни компоненти Резултати от анотирането на 1047 нагоре-регулирани гени в Stat5NKO мишки Epi-WAT изтегляне от Таблица 1. (D) Резултати от анотирането на клетъчни компоненти на 1106 надолу регулирани гени в Stat5NKO мишки Epi-WAT изтегляне от Таблица 1. (E) KEGG пътища резултатът е извлечен от 1047 гена, показани в таблица 1; (F) Резултатът от пътищата на KEGG е извлечен от 1106 гена, показани в таблица 1.

Диаграми на Venn и GO анотационен анализ на съвместно регулирани гени както в централната (хипоталамус), така и в периферната (Epi-WAT) тъкани (A-D). (A) Диаграмите на Venn са изготвени въз основа на RNA-seq набори от данни. Червените кръгове показват броя на регулираните нагоре или надолу гени в Epi-WAT (спрямо Stat5fl/fl група); зелените кръгове представляват броя на регулираните нагоре гени в хипоталамуса (спрямо групата Stat5NKO). Сините кръгове представляват броя на регулирани надолу гени в хипоталамуса (спрямо групата Stat5NKO). (B) GO анотация на съвместно регулирани гени в хипоталамуса и WAT на затлъстелите мишки Stat5NKO. (C) KEGG път за съвместно регулираните гени в хипоталамуса и WAT на затлъстелите мишки Stat5NKO. (D) Резултати от GO анотация на ко-надолу регулирани гени в хипоталамуса и WAT на затлъстелите мишки Stat5NKO.

Лечението с ЕА обърна абнормната генна експресия при затлъстелите мишки Stat5 NKO.

Лечението с ЕА промени ненормално експресираните гени както в хипоталамуса (A-E), така и в Epi-WAT на мишките Stat5NKO (F-I). (A) Областта на припокриване представлява надрегулиран номер на гена (310) в групата Stat5NKO (спрямо групата Stat5fl/fl), но намалена в групата EA; (Б) Топлинната карта е създадена, като се използват стойностите на FPKM на 310 припокриващи се гена в 5А; (C) Анализ на пътя на 310 припокриващи се гена в 5А. (D) Нивата на експресия на известни гени, участващи в сигналния път на PPAR, бяха променени в групата Stat5NKO (спрямо групата Stat5fl/fl) и някои бяха обърнати от EA; (E) Областта на припокриване представлява регулиран надолу генен номер (21) в групата Stat5NKO (срещу групата Stat5fl/fl), но увеличена в групата EA. (F) Анализ на пътя за 201 съвместно регулирани гени в Epi-WAT. (G) & (I) Диаграмите на Venn са изготвени въз основа на RNA-seq набори от данни. Червените кръгове показват броя на регулираните надолу или нагоре гени в групата Stat5NKO (срещу групата Stat5 fl/fl); зелените кръгове в (G, I) представляват броя на регулираните нагоре или надолу гени в групата EA (срещу групата Stat5NKO). (З) Топлинните карти са създадени с регулирани надолу гени в групата Stat5NKO и регулирани нагоре гени в групата Stat5NKO + EA. Нивата на експресия на регулираните нагоре и надолу регулирани гени са представени съответно в червен и зелен цвят.

Валидиране на RNA-seq данни

За да проверим нашите RNA-Seq данни, ние специално проверихме за известни гени, свързани с моногенното затлъстяване, свързани с фенотипа. Установихме, че 21 известни гена [18,26,27] се появяват в списъка за хипоталамуса на мишките Stat5NKO (Фигура 5А) и два от тях (Prl, Lep) са регулирани нагоре в хипоталамуса от групата Stat5NKO и са намалява с EA, но само един ген (Etv5) е регулиран надолу поради загубата на Stat5. В Epi-WAT 11 гена (Sec16b, Rasal2, Etv5, Slc39a8, Tfap2b, Nfe2l3, Faim2, Npc1, Sim1, Dgkg и Enpp1) бяха регулирани надолу от загубата на Stat5 и два от тях (Slc39a8 и Faim2) бяха значително регулирани от EA. Междувременно пет гена (Grb14, Pter, Mtch2, Gtf3a, Tmem160) бяха регулирани нагоре в групата Stat5NKO, а Grb14 беше регулиран надолу от EA. Освен това, ние открихме относителни експресии на mRNA на няколко гена чрез qRT-PCR в произволно избрана подгрупа от проби, за да тестваме допълнително валидирането на тези данни. Резултатите демонстрират, че тенденциите на RNA-seq данни и qRT-PCR данни са сходни (Фигура 5В).