Ракел Ксавие

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Порто, Португалия

Рената Мазей

2 Laboratoire d’Eco-Ethologie, Institut de Biologie, Université de Neuchâtel, Neuchâtel, Швейцария

Маркос Перес-Лосада

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Порто, Португалия

3 Институт по изчислителна биология, Катедра по епидемиология и биостатистика, Институт Milken School of Public Health, Университет Джордж Вашингтон, Ашбърн, Вирджиния, САЩ

Даниела Росадо

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Порто, Португалия

Джоана Л. Сантос

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Порто, Португалия

Ана Верисимо

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Порто, Португалия

Марта С. Соарес

1 CIBIO/InBIO, Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos da Universidade do Porto, Порто, Португалия

Свързани данни

Резюме

Широколентовият почистващ бик Elacatinus prochilos има два алтернативни екотипа: обитатели на гъби, които живеят на големи групи и се хранят предимно с паразити нематоди; и обитатели на корали, които живеят в малки групи или в самота и се държат като чистачи. Последните проучвания, фокусирани върху микробиомите на кожата и червата на тропическите риби, показват, че микробните съобщества се влияят главно от диетата и видовете гостоприемници. Тук сравняваме микробиомите на кожата и червата на карибския широколентов почистващ бик E. prochilos алтернативни екотипове (почистващи и нечистващи средства) от Барбадос и прогнозираме, че различното използване и поведение на местообитанията (почистване срещу нечистене) ще доведе до различни бактериални профили между двата екотипа. Открихме значителни разлики както в алфа-, така и в бета-разнообразието на микробиомите на кожата и червата, принадлежащи към различни екотипове. Важното е, че микробиомът на кожата на задължителните почистващи препарати показа по-голямо разнообразие в рамките на пробата и съдържа значително по-високо разпространение на потенциални рибни патогени. По същия начин потенциалните патогени също са по-разпространени в червата на задължителните почистващи препарати. Предполагаме, че използването на местообитания, диета, но също и пряк контакт с потенциално болна клиентела по време на почистване, може да бъде причината за тези модели.

Въведение

Тук сравняваме бактериалните съобщества от кожата и червата на алтернативните екотипове на Barbadian E. prochilos (гъби срещу корали), взети в две различни находища (биологични копия), за да проверим хипотезата, че различното използване на местообитанията и поведението ще водят до различни бактериални профили в двата екотипа. По-конкретно, ние предполагаме, че микробиомът на почистващите препарати ще бъде обогатен от потенциални патогени поради чести контакти с болни клиенти. За да постигнем тази цел, ще свържем високопроизводително секвениране на бактериалния 16S рРНК ген V4 регион с анализ на вариант на ампликон последователност.

Материали и методи

Вземане на проби и екстракция на ДНК

Данни и статистически анализи

Необработените FASTQ файлове бяха анализирани с помощта на платформата Quantitative Insights Into Microbial Ecology 2 (QIIME2; версия 2018.4). Чистите последователности бяха подравнени спрямо референтната база данни Silva (132) (Quast et al., 2012) с DADA2 тръбопровод (Callahan et al., 2016). Пробите бяха разредени до минималния брой на четене и бяха изградени две таблици с функции, съдържащи варианти на ампликон на последователността (ASV) от кожата и червата. Основният микробиом е оценен за кожата и червата, като се вземат предвид ASVs, присъстващи в 100% от пробите от всяка тъкан. За най-разпространените ASV във всяка тъкан (> 1% от представителните последователности) е създадена топлинна карта с помощта на опцията -p-normalize в QIIME2, която нормализира таблицата на характеристиките чрез добавяне на псевдоброене от 1 и използва log10 честотата за типа и родови нива.

Бактериалното таксономично алфа-разнообразие (интра-проба) се изчислява, като се използват индексите на Шанън, Фишър, Филогенетично разнообразие (PD), Равномерност и Симпсън, както е приложено в пакета R phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013). Бета-разнообразието на видовете (между пробите) беше оценено с помощта на разстояния между Bray – Curtis и филогенетичен Unifrac (непретеглени и претеглени). Неподобността между пробите беше оценена чрез анализ на основните координати (PCoA).

Различията в алфа-разнообразието между местообитания и местообитания бяха анализирани чрез извършване на анализ на линеен модел и ефектите на модела бяха оценени чрез използване на 1000 остатъчни рандомизации в процедура на пермутация, използвайки R пакета RRPP (Collyer et al., 2015). Разликите в бета-разнообразието в дадено населено място и местообитание бяха оценени с помощта на дисперсионния пермутационен анализ (1000 пермутации), както е приложено във функцията adonis на веганския R пакет. Разликите в състава на общността между екотипове бяха тествани с помощта на модели на линейна регресия за най-разпространените таксони (с> 1% представителни последователности).

Резултати

Таксономичен състав и основни бактериални общности в E. prochilos

Генерирани са общо 954 109 отчитания (537 084 за кожата и 417 025 за червата), с минимум 8 991 четения за проба и максимум 39 640. Тези последователности съответстваха на 1155 уникални ASV, от които бяха открити съответно 662 и 579 в кожата и червата на E. prochilos.

Двадесет и два от 25-те бактериални тила бяха открити в кожата, но само пет бяха представени от повече от 1% от последователностите (Фигура 1 и Допълнителна таблица S1). Членове на протеобактерии (80% от последователностите), Bacteroidetes (7,1%) и Firmicutes (2,2%) се срещат при всички индивиди (допълнителна таблица S1), като по този начин образуват основните бактериални съобщества на кожата. Членовете на Tenericutes (1,6% от последователностите) се срещат само при обитатели на корали (но само при 6 от 11 индивида) (Фигура 1 и допълнителна таблица S1). Единадесет семейства доминират в основните бактериални съобщества на кожата, като Pseudomonadaceae (около 18,5% от последователностите) и Beijerinckiaceae (около 47,2%) са най-разпространени (допълнителна таблица S1). На ниво род 10 идентифицирани рода са представени от> 1% от последователностите, като Methylobacterium (41,8% от последователностите), Pseudomonas (18,5%) и Janthinobacterium (1,5%), съдържащи основния микробиом (Фигура 1). Струва си да се отбележи, че потенциалните патогени от родовете Photobacterium и Vibrio са по-разпространени сред обитателите на корали, като първият род се среща само в този екотип (Фигура 1 и допълнителна таблица S1).

бизнес

Топлинна карта, изобразяваща абсолютното изобилие от ASVs, идентифицирани на нивата на типа и рода за кожния микробиом на двата екотипа.

Деветнадесет фила са открити в червата, но само шест са представени от повече от 1% от последователностите (Фигура 2 и допълнителна таблица S2). Само ASV, принадлежащи на протеобактерии (68% от последователностите), са открити при всички индивиди, взети от пробите (Фигура 2 и допълнителна таблица S2). Основните бактериални съобщества, присъстващи в червата, са съставени само от Beijerinckiaceae, които представляват 50% от последователностите (Фигура 2 и Допълнителна таблица S2). Седем рода се считат за изобилни в червата (Фигура 2 и допълнителна таблица S2) и от тях само Methylobacterium (Beijerinckiaceae) (около 50% от последователностите) присъства при всички индивиди. Както в кожата, потенциалните патогени от Photobacterium и Vibrio имат по-голямо разпространение сред обитателите на коралите (Фигура 2).

Топлинна карта, изобразяваща абсолютното изобилие на ASVs, идентифицирани на нивата на типа и рода за чревния микробиом на двата екотипа.

Анализи на бактериалното разнообразие

Алфа-разнообразието на микробиома на кожата е значително различно между екотиповете, като обитателите на корали показват постоянно по-високи индекси на алфа-разнообразие, оценени от Шанън (F = 13,786, p = 0,002), Симпсън (F = 20,162, p = 0,001) и равномерност ( F = 17,807, p = 0,001) индекси (вижте фигура 3 и допълнителни таблици S3, S4). Находище или терминът за взаимодействие локалност * екотип не оказва влияние върху микробното алфа разнообразие. Установени са също значителни разлики в бета-разнообразието между екотипове, използващи филогенетично претеглено Unifrac (R 2 = 0,224 и p = 0,005) и разстояния между Bray – Curtis (R 2 = 0,098 и p = 0,007) (допълнителна таблица S3 и фигура 4А). По същия начин местонахожденията за вземане на проби също показват значителни разлики в бета-разнообразието за разстоянието Bray – Curtis (R 2 = 0,087, p = 0,018) (допълнителна таблица S3 и фигура 4A).

Графични кутии, изобразяващи средни стойности и стандартни отклонения на индексите на алфа разнообразие за микробиома на кожата и червата на населено място и екотип.

(А) PCoA графики, изобразяващи претеглени и непретеглени разстояния на Unifrac и разстояния на Bray-Curtis за микробиома на кожата; и (Б) Графики PCoA, изобразяващи претеглени и непретеглени разстояния на Unifrac и разстояния на Bray-Curtis за чревния микробиом.

Анализът на средните пропорции на таксоните показа значителни разлики в изобилието на Vibrionaceae (F-статистика = 6,057, p = 0,023) и Beijerinckiaceae (F-статистика = 19,34, p Фигура 3 и допълнителни таблици S3, S4). Анализът на бета-разнообразието обаче разкрива значителни разлики между екотиповете (R 2 = 0,125, p = 0,038) и местоположението на екотип ∗ за едно от трите тествани разстояния (филогенетично претеглено Unifrac) (R 2 = 0,116; p = 0,037) ( Допълнителна таблица S3 и фигура 4B). Анализът на средните пропорции на таксоните показа значителни разлики между екотиповете за уреаплазма (Mycoplasmataceae, Tenericutes) (F-статистика = 6.105; p = 0.022), което беше почти изключително за екотипа, обитаващ корали (допълнителна таблица S1).

Дискусия

Настоящото проучване описва основните бактериални съобщества на кожата и червата на E. prochilos и разликите между два алтернативни екотипа (почистващи и нечистващи) в Барбадос. Като цяло, микробиомът на кожата на почистващите препарати, обитаващи корали, показва постоянно по-голямо разнообразие в пробите и съдържа значително по-високо разпространение на потенциални рибни патогени, потвърждаващи нашите първоначални хипотези.

Таксономичен състав и основни бактериални общности в E. prochilos

Кожният микробиом на сърцевината на E. prochilos е по-разнообразен от този на червата, като първият се състои от протеобактерии, бактерии и твърди вещества, докато вторият включва само протеобактерии от рода Methylobacterium (Beijerinckiaceae). Бактериалните профили, съобщени тук за микробиомите на кожата и червата на E. prochilos, са подобни на тези, публикувани преди за други телеости (напр. McDonald et al., 2012; Larsen et al., 2014; Lokesh and Kiron, 2016; Carda-Diéguez и др., 2017; Rosado et al., 2019), включително други риби от коралови рифове (Chiarello et al., 2018).

Различия в бактериалното разнообразие между E. prochilos Екотипове

В сравнение с обитателите на гъби, микробиомът на кожата на почистващите препарати от корали е значително обогатен с Vibrionaceae (повече от 6 пъти), бактериално семейство, за което е известно, че включва няколко рибни патогени (вж. Например Austin, 2011 за преглед). В това семейство ASV от Vibrio и Photobacterium имат по-голямо разпространение в по-чистия екотип. Известно е, че тези два рода приютяват множество патогени, способни да заразяват риби по целия свят, включително тропически видове (Landsberg, 1995; Panek, 2005; Gomez-Gil et al., 2007). Всъщност изобилието от вибрио е значително по-голямо в кожата на обитателите на корали. Това подкрепя нашата първоначална хипотеза, че предаването на патогени може да се случи от болни клиенти.

Разликите в таксоните, открити в червата, бяха по-фини. Сред най-разпространените таксони в червата само един ASV, принадлежащ на Ureaplasma, варира значително между екотиповете. Независимо от това, взаимодействието между местността за вземане на проби и екотипа оказа ефект върху бета-разнообразието (Weighted Unifrac). Това е донякъде изненадващо, тъй като няколко проучвания показват, че диетата има значителен ефект върху чревния микробиомен състав на рибите (вж. Рецензиите на Tarnecki et al., 2017; Egerton et al., 2018).

Заключение

Резултатите от това проучване показаха, че бактериалните съобщества на кожата на двата алтернативни екотипа на E. prochilos могат да бъдат разграничени с помощта на 16S rRNA генни последователности, дори и сред риби, уловени само на 10 s на метър. Освен това, микробиомът на кожата на обитаеми корали (почистващи препарати) съдържа по-голямо бактериално разнообразие, включително значително по-висок дял от потенциални рибни патогени (напр. Vibrio и Photobacterium). Предлагаме използването на местообитанията, диетата и социалната ангажираност, поради чести физически контакти с потенциално болни клиенти, могат да доведат до значителни разлики в разнообразието и изобилието от патогенни бактерии между по-чистите и нечистите екотипове на E. prochilos.

Декларация за етика

Това проучване е проведено в съответствие с препоръките на звеното за управление на крайбрежната зона (CZMU) в Барбадос. Протоколът е одобрен от министъра на околната среда от името на CZUM (референтен номер на разрешителното: CZ01/9/9).

Принос на автора

RX, MS и RM замислят работата. RM събра рибата. RX и JS проведоха лабораторната работа. RX, MP-L и DR проведоха анализ на данните. Всички автори са допринесли за написването на ръкописа.

Изявление за конфликт на интереси

Авторите декларират, че изследването е проведено при липса на каквито и да било търговски или финансови отношения, които биха могли да се тълкуват като потенциален конфликт на интереси.

Благодарности

Благодарим на J. Germain, S. Tide, H. Valles, L. Waterman и R. Bshary за логистична подкрепа и помощ при събирането на бикини и S. Cardoso за помощта при ръкописния формат. Също така благодарим на служителите на изследователския институт Bellairs за логистична подкрепа.

Бележки под линия

Финансиране. RX, MS, MP-L, AV и DR в момента бяха подкрепени от FCT по Програмата Operacional Potencial Humano - Quadro de Referência Estratégico Nacional от Европейския социален фонд и португалското Ministério da Educação e Ciência (MS: SFRH/BPD/109433/2015; RX: IF/00359/2015; AV: SFRH/BPD/77487/2011; DR: SFRH/BD/117943/2016). RM беше подкрепена със стипендия от Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Brazil (CNPq). Изследванията са подкрепени от Европейския фонд за регионално развитие (ЕФРР) чрез програма COMPETE и от националните фондове чрез FCT - Фондация за наука и технологии (проекти PTDC/MAR-BIO/0902/2014- POCI-01-0145- FEDER-016550; и PTDC/BIA-MIC/27995/2017- POCI-01-0145-FEDER-027995).