Тази статия има поправка. Моля виж:

В края на 1994 г. Zhang et al. (1) публикува изключително важна статия, в която е описана структурата на гена за затлъстяване (ob) на мишката и неговия човешки хомолог чрез позиционно клониране. Протеинът, наречен лептин, е продукт на ob гена. Затлъстяването при ob/ob мишка се дължи на мутация в гена, водеща до неуспех в секрецията на лептин от адипоцитите. Лептинът причинява загуба на тегло при мишки, като намалява приема на храна и увеличава разхода на енергия (2–5). Освен това, експресията на гена ob се увеличава при човешкото затлъстяване (6–9) и при различни животински модели на затлъстяване (10). Натрупаните доказателства сочат, че лептинът е важен за контролиране на телесното тегло.

лептина

Не само ob/ob мишката е безплодна, но има атрофични репродуктивни органи (11). Секрецията на гонадотропин е нарушена и много чувствителна към отрицателната обратна връзка на гонадалните стероиди, както при препубертатни животни (12). Наскоро беше показано, че хроничното лечение с лептин може да индуцира възстановяване в репродуктивната система на ob/ob мишката чрез насърчаване на растежа и функцията на репродуктивните органи и плодовитостта (13, 14) чрез увеличаване на секрецията на гонадотропини (15).

Хипотезата за критичното тегло за развитието на пубертета гласи, че когато телесното тегло достигне определено ниво, настъпва пубертет (16). Тази хипотеза в първоначалния си вид не се поддържа, тъй като, ако плъховете са недохранени, пубертетът се забавя, но с достъп до храна, бързото наддаване на тегло води до настъпване на пубертета при тегло, доста под критичното тегло при нормални хранителни условия (17) Следователно пубертетът вероятно се предизвиква, когато запасите от мазнини достигнат определено ниво (16, 17). Ние предположихме, че когато запасите от мазнини достигнат критичната точка, има повишено освобождаване на лептин от адипоцитите в кръвта. След това лептинът действа върху хипоталамусните клетки, за да стимулира освобождаването на лутеинизиращ хормон (LH)-освобождаващ хормон (LHRH), като по този начин задейства освобождаването на гонадотропин. Последващото освобождаване на фоликулостимулиращ хормон (FSH) и LH стимулира секрецията на гонадни стероиди, което води до развитие на репродуктивния тракт и индукция на пубертета.

Поради това инициирахме проучвания за възможните ефекти на лептина върху хипоталамо-хипофизната функция. Ние предположихме, че лептинът също ще играе роля в контрола на секрецията на гонадотропин при възрастни животни и следователно проучихме неговите ефекти върху освобождаването на FSH и LH от полупредни хипофизи (APs), както и възможното му действие при освобождаване на LHRH от медиалния базален хипоталамусни експланти in vitro. За да определим дали лептинът е активен in vivo, използвахме модел, който често използвахме, за да оценим стимулиращите ефекти на пептидите върху освобождаването на LH, а именно овариектомизираните, грундирани с естроген плъхове (18). Микроинжектирахме протеина в третата камера (3V) на съзнателни животни, носещи имплантирани 3V канюли, а също и катетри във външната югуларна вена, простираща се до дясното предсърдие, за да можем да извадим кръвни проби преди и след инжектирането на лептин и да измерим неговия ефект върху концентрациите на плазмен FSH и LH.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Възрастни мъжки и женски плъхове от щама Sprague – Dawley (Holtzmann, Madison, WI; 200–250 g) са настанени по двама в клетка при контролирани условия на температура (23–25 ° C) и осветление (от 0500 до 1700 часа) . Животните имаха свободен достъп до гранулирана диета и чешмяна вода.

Ин витро изследвания.

След аклиматизация в продължение на 5 или повече дни във вивариума мъжките плъхове бяха убити чрез обезглавяване.

Инкубация на AP.

След отстраняване на задния лоб, предната част на хипофизата се разделя надлъжно и всеки AP се инкубира в епруветка, съдържаща 0,5 ml бикарбонат на Krebs – Ringer (1 mg/ml аскорбинова киселина; pH 7,4) буфер (KRB) в атмосфера от 95 % O2/5% CO2 в шейкър Dubnoff (50 цикъла в минута) за период от 60 минути. След тази преинкубация AP се инкубират в продължение на 3 часа само в свеж KRB буфер или KRB, съдържащ градуирани концентрации на лептин [рекомбинантен човешки лептин, подарък на Дейвид Йорк (Pennington Biomedical Research Center) от CIBA Pharmaceutical]. След това средата беше аспирирана и съхранявана замразена при -20 ° C, докато бяха направени измервания на FSH, LH и пролактин чрез радиоимуноанализ (RIA), използвайки комплекти, предоставени от Националния институт по храносмилателен диабет и бъбречни заболявания (NIDDK).

Инкубация на средна височина (ME) - Аркутатни ядрени (дъгови) обяснения.

Експлантите се дисектират чрез единичен разрез, така че да се получи експлант, съдържащ МЕ, стъблото на хипофизата, надлежащото дъговидно ядро ​​(AN) и съседната тъкан. Разрезът се простира от само каудален до оптичния хиазъм обратно до точно каудален до точката на отделяне на стъблото на хипофизата. Това доведе до парче тъкан ≈2 mm рострокаудално, с дълбочина 0,25 mM и простиращо се на 0,25 mm двустранно от средната линия. Всеки ME-Arc експлант е предварително инкубиран в епруветка, съдържаща 0,5 ml KRB за 30 минути преди заместване с прясна среда или среда, съдържаща лептин или разредител (KRB). След инкубация в продължение на 30 минути средата се аспирира, запазва и замества с еднакъв обем прясна среда, съдържаща същата концентрация на лептин. Инкубацията продължава още 30 минути. По това време средата беше аспирирана, варена в продължение на 10 минути на водна баня и съхранявана замразена, преди определяне на LHRH от RIA с помощта на високо специфично антитяло към LHRH, любезно дарено от A. Barnea (University of Texas Southwestern Medical Center, Далас ). Минималният откриваем LHRH е 0.2 pg на тръба, а кривата е линейна до 100 pg. Всички експерименти in vitro се повтарят поне три пъти. Представените резултати са от представителни експерименти.

In Vivo изследвания.

Възрастни женски плъхове от Holtzmann (200–250 g) бяха овариектомизирани под халотанова анестезия 5 или повече дни след получаването и бяха използвани 3-4 седмици по-късно.

В 3V 6–8 дни преди експериментите беше имплантирана постоянна канюла, използвайки техниката на Antunes-Rodrigues и McCann (19) и триброметанолова анестезия. Три дни преди експеримента на плъховете се инжектира s.c. с 10 μg естрадиол бензоат в масло (0,1 ml). Един ден преди експеримента, докато плъхът беше упоен с халотан, постоянен катетър беше въведен в дясната външна вратна част и придвижен до дясното предсърдие за събиране на кръвни проби, съгласно техниката на Harms и Ojeda (20). Веднага след събирането на първата кръвна проба (0,3 ml), 10 μg лептин, разтворен в 5 μl KRB или KRB само, се инжектират в 3V в продължение на 60 секунди. Допълнителни (0,3 ml) кръвни проби се събират на всеки 10 минути в продължение на 120 минути. Инжектиран е равен обем физиологичен разтвор веднага след отстраняване на всяка кръвна проба, за да се възстанови обемът на кръвта.

След центрофугиране плазмата се съхранява при -20 ° C преди RIA за FSH, LH и пролактин и се изразява в референтните препарати NIDDK RP-3, RP-2 и RP-3, съответно.

Статистика.

Резултатите бяха анализирани чрез еднопосочен анализ за дисперсия с повтарящи се измервания и значимостта на разликите между средните стойности беше определена с теста на Student-Newman-Keuls. Разликите между средните стойности на две групи са изчислени чрез t тест на Student.

РЕЗУЛТАТИ

Ефект на лептина върху освобождаването на LH.

Лептинът индуцира звънчеста крива доза-отговор на освобождаване на LH от инкубирани AP (фиг. 1). Минималната ефективна доза беше 10-11 М и освобождаването остана на плато, тъй като концентрацията на лептин беше увеличена до 10-7 М. Освобождаването намаля с най-високата тествана концентрация (10-5 М) и вече не се увеличи значително. Освобождаването на LH от лептин не е значително по-малко от това, причинено от LHRH с подобна концентрация (4 × 10 -9 M). При тези условия не е имало допълнително освобождаване на LH, когато лептин (10 -7 или 10 -5 M) се инкубира заедно с LHRH (4 × 10 -9 M). В някои други експерименти имаше адитивен ефект, когато лептинът се инкубира с LHRH; този ефект обаче не се наблюдава еднообразно. Резултатите показват, че лептинът е малко по-малко ефективен при освобождаването на LH, отколкото самият LHRH.

Ефектът на лептина върху освобождаването на LH от AP, инкубирани in vitro. Имаше осем отделни AP, инкубирани във всяка група. В тази и следващите фигури височината на всяка колона представлява средния отговор при всяко лечение. Вертикалната линия над колоната = 1 SEM. Звездичките показват значимост спрямо KRB контрола: ∗, P −9 M, докато за LH беше 10 −11 M. Отговорите бяха приблизително със същата величина при ефективната концентрация, получена с LH, и отговорът беше еквивалентен на този, наблюдаван при 4 × 10 −9 M LHRH. Комбинацията от LHRH с неефективна концентрация на лептин, която освобождава FSH на ниво малко под значимостта, дава явен адитивен ефект върху освобождаването на FSH (Фиг. 2).

Ефектът на лептина върху освобождаването на FSH от AP, инкубирани in vitro.

Ефект на лептина върху освобождаването на пролактин.

Резултатите с пролактин са в контраст с тези с FSH и LH, тъй като максималният отговор (4,5-кратно увеличение) се наблюдава при най-високата тествана концентрация (10-5 M) и освобождаването на пролактин се увеличава в зависимост от дозата с концентрации > 10 -7 М лептин (фиг. 3).

Ефектът на лептина върху освобождаването на пролактин от AP, инкубирани in vitro.

Ефект на лептина върху освобождаването на LHRH от ME-Arc Explants.

Нямаше значителен ефект на лептина (10 -12 -10 6 М) върху освобождаването на LHRH от експланти на ME-Arc през първите 30 минути на инкубацията; през вторите 30 минути обаче най-ниските концентрации (10-12 и 10-10 М) предизвикват плато значително увеличение на освобождаването на LHRH. Общото значение, комбиниращо резултатите с двете стимулиращи концентрации, е P −6 M; Фиг. 4).

Максималното увеличение на LH в плазмата през първия час след инжектиране на лептин [10 μg (0,6 nmol) в 5 μl KRB] или равен обем от разредителя (KRB) в 3V на плъхове, овариектомирани, инжектирани с 10 μg естрадиол бензоат sc 72 часа преди експеримента.

ДИСКУСИЯ

Нашите резултати показват, че лептинът има много мощен ефект върху предната част на хипофизата in vitro. Той стимулира освобождаването на FSH и LH в рамките на 3 часа след инкубацията. Ефектът понякога е бил адитивен при LHRH и не е имало значителна разлика между освобождаването на FSH и LH от еквивалентни концентрации на LHRH и лептин. От друга страна, имаше много по-изразена стимулация на освобождаването на пролактин при високи концентрации, надвишаваща всички индуцирани повишения, които сме наблюдавали по-рано. Това беше още по-забележително, като се има предвид, че освобождаването на пролактин вече се увеличава от предните хипофизи in vitro поради премахване на инхибиторния контрол на хипоталамуса (21).

Бяхме изненадани да видим такива забележителни увеличения на освобождаването на гонадотропин от инкубираните хипофизи, които биха могли да имат физиологично значение. Не са докладвани рецептори за лептин в предната част на хипофизата; въпреки това, въз основа на нашите резултати, те трябва да присъстват в секреторните клетки на жлезата, като гонадотропите.

Предполага се, че когато лептинът се секретира от адипоцитите, той циркулира в хипоталамуса и дифузира от хипофизарните портални капиляри в МЕ, околоклетъчен орган, без кръвно-мозъчна бариера. Останалият лептин в порталните капиляри се транспортира от дългите портални вени до предната част на хипофизата. Артериалното кръвоснабдяване на нервния лоб доставя лептин директно в този лоб на хипофизата. Оттам се транспортира до предния лоб чрез късите портални съдове, които представляват останалите 30% от притока на кръв към предния лоб. В предния лоб лептинът се комбинира с ob/obb рецептори (22), за да увеличи освобождаването както на FSH, така и на LH и може също да увеличи отговора на LHRH.

Налице е значително освобождаване на LHRH от ME-Arc експланти при най-ниските тествани концентрации на лептин (10-12 и 10-10 М), което се е случило след закъснение от 30-60 минути. Други пептиди или цитокини, които сме оценили, са се активирали в рамките на 30 минути (23). Причината за забавянето с лептин не е очевидна. Следователно лептинът стимулира освобождаването на гонадотропин както чрез хипоталамусно, така и чрез хипофизно действие (Фиг. 6).

Диаграма на вероятното действие на лептина за стимулиране на освобождаването на LHRH и гонадотропин. На, зрителния нерв; PP, задна хипофиза.

Лептинът освобождава LH, но не и FSH, с променливо времезакъснение (10–50 минути), след инжектиране на 3V при плъхове, подложени на овариектомия, грундирани с естроген. Предполага се, че този ефект е причинен от освобождаването на LHRH; обаче е вероятно и директен ефект върху гонадотропите за освобождаване на LH, с оглед на неговата способност да освобождава LH от хипофизите, инкубирани in vitro. Разликата във времето за забавяне на освобождаването на LH при отделни плъхове може да бъде причинена от разликите в разстоянието от върха на канюлата в 3V до AN, предполагаемото място на действие на лептина.

Изглежда, че лептинът достига до мозъка чрез транспортен механизъм (24), медииран от ob/oba рецепторите (22) в хороидния сплит (22). Тези рецептори имат обширен извънклетъчен домен, но силно пресечен вътреклетъчен домен (22) и медиират транспорта на хормона чрез наситен механизъм (24). След поглъщане в цереброспиналната течност през хороидалния сплит, лептинът се пренася от потока на цереброспиналната течност към 3V, където или се дифундира в хипоталамуса през епендималния слой, облицоващ вентрикула, и се комбинира с ob/obb рецептори (25) на паравентрикуларни ядра (PVN) и AN неврони или върху рецептори на терминалите на реагиращите неврони, които се простират до вентрикуларната стена.

Хипотетичен механизъм на действие на лептина за предизвикване на стимулиране на освобождаването на LHRH. За обяснение, моля вижте текста. NPYn, NPY неврон; Лептин r, лептинов рецептор; NPYr, NPY рецептор; NEn, норадренергичен невронен терминал; NOn, нитроксидергичен неврон; ARG, аргинин; NOS, NO синтаза; Cit, цитрулин; α1r, α1 адренергичен рецептор; gc, гуанилат циклаза; цикло, циклооксигеназа; PV, портален съд; +, стимулация; -, инхибиране.

Предполагаме, че лептинът може да бъде критичен фактор за предизвикване на пубертета, тъй като животното се доближава до така нареченото критично тегло. Или метаболитните сигнали, достигащи до адипоцитите, или сигналите, свързани със съдържанието им на мазнини, предизвикват освобождаването на лептин, което увеличава освобождаването на LHRH и гонадотропина, като по този начин инициира пубертета и накрая овулацията и началото на естрозните цикли. При мъжете системата ще работи по подобен начин; обаче няма преовулаторен скок на LH, предизвикан от положителната обратна връзка на естрадиола. Чувствителността към лептин несъмнено е под контрол на гонадни стероиди (A.W., W.H.U. и S.M.M., непубликувана работа).

По време на гладуване, лептиновият сигнал се отстранява и LH пулсативността и репродуктивната функция намаляват доста бързо. Всъщност току-що беше съобщено, че гладуването при мишки причинява спиране на естрозните цикли, които могат да бъдат възстановени чрез повторно хранене или приложение на лептин в продължение на 2 дни, което е придружено от повишаване на плазмения LH (33). При жените с анорексия нервна хипотеза предполагаме, че намаленият прием на храна води до намалена секреция на лептин, което води до намалено освобождаване на гонадотропин, което води до връщане в предпубертетно състояние. Предпубертетното състояние може да бъде обърнато чрез повишен прием на калории и произтичаща секреция на лептин от адипоцитите.

Последиците от секрецията на гонадотропин от свръхпроизводството на лептин, както вече е доказано при затлъстяването при хора (6–9), не са ясни. Често има репродуктивни аномалии при това обстоятелство и дали те се дължат на излишък от производство на лептин или други фактори, предстои да се определи. Прави впечатление, че най-високата концентрация на лептин, тествана in vitro, намалява, вместо да увеличава, LHRH. По този начин лептинът може да има мощно влияние върху репродукцията през целия живот на индивида чрез действия върху хипоталамуса и хипофизата.

Благодарности

Благодарим на Джуди Скот и Джейсън Холанд за отличната помощ на секретарите. Тази работа беше подкрепена от Националните здравни институти за безвъзмездна помощ DK43900 и MH51853.

Бележки под линия

↵ До кого трябва да бъдат отправени искания за повторно отпечатване. e-mail: mccannmhs.pbrc.edu .

Съкращения: LH, лутеинизиращ хормон; LHRH, LH-освобождаващ хормон; FSH, фоликулостимулиращ хормон; 3V, трета камера; AP, полу-предна хипофиза; KRB, буфер Krebs – Ringer бикарбонат; ME, средна възвишеност; Дъга, дъгообразна ядрена; AN, дъговидно ядро; PVN, паравентрикуларни ядра; NPY, невропептид Y.