Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Кореспонденция

Е. И. Денисова, Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, проспект Лаврентьева 10, Новосибирск 630090, Русия

Факс: +7 383 333 12 78

Тел: +7 383 363 49 63

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Катедра по физиология, Новосибирски държавен университет, Новосибирск, Русия

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Кореспонденция

Е. И. Денисова, Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, проспект Лаврентьева 10, Новосибирск 630090, Русия

Факс: +7 383 333 12 78

Тел: +7 383 363 49 63

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Катедра по физиология, Новосибирски държавен университет, Новосибирск, Русия

Лаборатория по физиологична генетика, Институт по цитология и генетика, Сибирския клон на Руската академия на науките, Новосибирск, Русия

Резюме

Съкращения

Според парадигмата ‘Развитие на произхода на здравето и заболяванията’ здравето на индивида зависи от вътрематочните и ранните постнатални условия [1]. Доказано е, че затлъстяването по време на бременност увеличава риска от метаболитни заболявания при потомството [2]. Остава обаче неизвестно кои фактори от майчината среда предизвикват промени във фенотипите на потомството и механизмите, които медиират дългосрочните ефекти на тези фактори.

Адипоцитният хормон лептин играе ключова роля в регулирането на енергийната хомеостаза [3], а нивата на циркулиращия лептин са пропорционални на мастната маса на тялото [4]. Значителен брой проучвания показват, че лептинът участва в програмирането на развитието [5-8]. Защитен ефект срещу затлъстяване при потомството е открит, когато лептин е прилаган през цялата бременност или през втората половина на бременността при плъхове и мишки на стандартна диета [5, 7, 9, 10]. Доказано е обаче, че приемането на лептин по време на ранна бременност и в средата на бременността при мишки с ограничена храна увеличава склонността на женските потомци да развиват индуцирано от диетата затлъстяване (DIO) [11]. Ефектите от програмирането на лептин вероятно зависят от времето на приложението му, хранителните условия на майката и пола на потомството.

Лептинът може да повлияе развитието на плода чрез влиянието му върху плацентарните функции [12]. Плацентата снабдява плодовете с хранителни вещества и растежни фактори, като по този начин определя скоростта на растеж на плода и теглото при раждане на потомството [13, 14]. На свой ред теглото при раждане предсказва бъдещото здраве на индивида. При хората теглото при раждане, което е твърде ниско или твърде високо, е свързано с повишен риск от диабет тип 2 и затлъстяване [15, 16]. При мишки се наблюдава сексуален диморфизъм за плацентарния отговор на затлъстяването по време на бременност [17, 18]. Това предполага, че някои свързани със затлъстяването майчини фактори (включително повишен лептин) могат по различен начин да повлияят на функциите на плацентите на мъжки и женски плодове. Не е известно дали майчиният лептин влияе върху скоростта на растеж на плода и експресията на хранителни транспортери и растежни фактори в плацентата в средата на бременността и дали плацентарният отговор на действието на лептина е специфичен за пола.

Целта на настоящото проучване беше да се изследват ефектите от прилагането на лептин върху мишки по време на средата на бременността върху метаболитните фенотипове на потомството, теглото на плода и експресията на гени в плацентите според пола на потомството. Установихме, че приложението на лептин при бременни мишки диференцирано повлиява някои фенотипни черти на мъжкото и женското потомство и този ефект е свързан с временно ограничаване на растежа на плода и специфичен за пола плацентарен отговор на инжекциите на лептин. Предлагаме, че специфичният за пола ефект на програмиране на лептин, прилаган в средата на бременността, може да бъде свързан с различните му действия върху плацентите на мъжки и женски плодове.

Методи

Етично одобрение

Всички експерименти са извършени в съответствие с Ръководството за грижа и използване на лабораторни животни (1996) и руските национални инструкции за грижи и употреба на лабораторни животни. Протоколите са одобрени от Независимия комитет по етика на Института по цитология и генетика (Сибирски отдел, Руска академия на науките).

Диети

Стандартната чау-диета се доставя под формата на гранули и е закупена от Assortiment Agro (Московска област, Тураково, Русия). Обезогенната храна включва сладки бисквити с масло, свинска мас и слънчогледови семки. Животните са получавали обезогенна храна в допълнение към стандартната чау. Животните са получавали излишни количества от всяка храна, включително чау, така че приемът им да е бил ad libitum.

Животни

Мишките C57BL/6J бяха закупени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, САЩ) и след това бяха отгледани във вивариума на Института по цитология и генетика. Мишките бяха настанени под 12: 12-часов режим светлина-тъмнина (7 часа 30 минути-19 часа 30 минути светлина) при температура на околната среда от 22 ° C. Мишките бяха осигурени ad libitum достъп до търговска мишка и вода за мишки.

Женските се чифтосват с мъжките на възраст 10-14 седмици и са настанени поотделно от деня на откриване на копулационен щепсел (гестационен ден 0, GD0). На GD12, женските получават подкожни инжекции от рекомбинантен миши лептин (4,0 µg · g -1 BW), разтворен във физиологичен разтвор до крайна концентрация от 500 µg · ml -1 или инжектирани с физиологичен разтвор (контролен) за 9 h 00 min. Според предишните ни изследвания, лептин, приложен в тази доза на мишки в края на бременността, не е повлиял жизнеспособността на потомството, но това приложение е повлияло фенотипа на потомството [5]. Мишките, прилагани от лептин и физиологичен разтвор, бяха разделени на три експериментални групи.

В една група 14 лекувани с лептин и 17 лекувани с физиологичен разтвор жени бяха претеглени преди и 24 часа след инжектирането и бяха умъртвени чрез бързо обезглавяване. Бяха събрани проби от кръвта им в ствола и бяха претеглени плодовете и плацентите им. Феталните чернодробни проби бяха събрани и бързо замразени в течен азот за последващо определяне на пола.

Във втората група девет лекувани с лептин и девет третирани с физиологичен разтвор мишки бяха умъртвени 7 часа след инжектирането на лептин, а пробите от всяка плацента и фетален черен дроб бяха замразени бързо в течен азот. Когато бяха открити половете на плодовете, бяха избрани плацентите от шест лекувани с лептин и шест лекувани с физиологичен разтвор, за да се изследва плацентарната генна експресия. Избраните язовири имаха седем до девет плода и два или повече плода от двата пола. Най-леките и тежки плаценти в едно котило бяха изключени от анализа на генната експресия, тъй като беше показано, че размерът на плацентата влияе върху експресията на гени, кодиращи транспортерите на глюкоза и аминокиселини [19] .

Третата група се използва за изследване на влиянието на приложението на лептин върху фенотипите на потомството. При раждането малките, родени от девет лекувани с лептин и седем третирани с физиологичен разтвор женски, бяха претеглени, а котилата, съдържащи повече от седем малки, бяха намалени до седем малки. Измерваха се телесните тегла на малките (BW) в следродилни дни 1, 7, 14, 21 и 28. На 28 ден след раждането двама мъже и две жени от всяко котило бяха отделени от майките си и настанени поотделно, а техните BW и приемът на храна (FI) бяха измервани веднъж седмично до 16-седмична възраст. През този период всички животни са били хранени със стандартна диета с чау ad libitum. От 16-седмична възраст един мъж и една жена от всяко кучило продължават да получават стандартна диета, а един мъж и една жена започват да получават бисквити, свинска мас и слънчогледови семена в допълнение към стандартната чау. Тази смес имитира диетата в кафенето и засилва бързото развитие на затлъстяване при мишки [5]. BW на мишката се измерват веднъж седмично в продължение на 8 седмици. Консумацията на обезогенна храна не е измерена. В края на експеримента животните се умъртвяват чрез обезглавяване, събират се проби от кръв и се измерва теглото на коремните мастни накладки.

Материали

Миши рекомбинантен лептин е закупен от PeproTech (Принстън, Ню Джърси, САЩ).

Плазмени анализи

Концентрациите на лептин се измерват с търговски комплекти (лептин: R&D Systems, Минеаполис, Минесота, САЩ, интра-анализ: 3,8–4,3%; интераси: 3,8–5%). Концентрациите на глюкоза в плазмата са измерени с помощта на търговски комплект (Fluitest GLU; Analyticon Biotechnologies, AG 35104, Lichtenfels, Германия).

Относителна количествена PCR в реално време

Определяне на феталния пол

Половете на плодовете са определени с помощта на геномна ДНК PCR със следните праймери: SX_F, 5′ ‐ GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA ‐ 3 ′; SX_R, 5′ ‐ CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA ‐ 3 ′ [20]. ДНК се извлича от фетален черен дроб със солен разтвор според Aljanabi и Martinez ([21]) [19]. Полът е определен при приблизително 85% от плодовете.

Статистически анализ

Резултати

Влияние на приложението на лептин върху язовири върху GD12 върху теглото на майките, техните плодове и техните плаценти

Ефектите на лептина върху теглото на майките, техните плодове и плаценти зависят от времето, изминало след инжектирането. Обработените с лептин и физиологичен разтвор язовири не се различават по своите промени в BW (-1,2 ± 0,3%, н = 9; -1,1 ± 0,4%, н = 9; физиологичен разтвор и лептин, съответно), но се различават по теглото на техните плодове в рамките на 7 часа след инжектирането. В сравнение с резултатите от прилагането на физиологичен разтвор, приложението на лептин води до пропорционално намаляване на теглото на мъжките плодове (P

върху

Физиологичен разтвор на лептин P (Студентски т-тест)
Печалба от женски BW (% от първоначалната) 4,7 ± 0,7 (17) 2,0 ± 0,08 (14) 0,02
Размер на котилото 6,8 ± 0,3 (17) 6,9 ± 0,5 (14) NS
Плазмени концентрации на лептин (ng · mL -1) 6,3 ± 1,3 (8) 10,1 ± 2,2 (7) NS
Плазмени концентрации на глюкоза (m m) 7,2 ± 0,4 (8) 7,5 ± 0,4 (7) NS

Влияние на приложението на лептин върху язовири върху GD12 върху метаболитните фенотипове на потомството

Потомство BW преди отбиването и FI и BW след отбиването

Прилагането на лептин на язовири на GD12 не е повлияло жизнеспособността или теглото на плода в края на бременността: броят и теглото на новородените малки са били равни при лекуваните с лептин и физиологичен разтвор ядки (Таблица 1, Фиг. 2).

Прилагането на лептин намалява скоростта на растеж на малките от 7 до 28 дни след раждането и значително намалява BW както на женското, така и на мъжкото потомство преди отбиването (Фигури 2 и 3).

След отбиването потомството на лекуваните с лептин язовири демонстрира скок на растежа, който им позволи да наваксат (фиг. 3). През първите 2 седмици след отбиването, мъжкото потомство, но не и женското потомство на лекуваните с лептин язовири са имали значително по-голямо наддаване на тегло от тези на контролните майки [5,66 ± 0,38 g (н = 12) и 7,31 ± 0,28 g (н = 17), P

Отговор на потомството към обезогенната диета

Обезогенната диета индуцира развитието на затлъстяване както при мъжете, така и при жените (P

Влияние на приложението на лептин върху генната експресия в плацентите

Сравнението на генната експресия в плацентите на мъжки и женски плод разкрива зависими от пола разлики в нивата на mRNA на аминокиселинните транспортери SNAT2 (P

Дискусия

В това проучване тествахме предположението, че програмният ефект на лептин, прилаган на мишки по време на средата на бременността, може да зависи от пола на потомството. Освен това предположихме, че всякакви разлики във функционалните отговори на плацентите на мъжкия и женския плод могат да бъдат в основата на зависимото от пола действие на програмирането на лептина. Инжектирахме лептин веднъж върху GD12 и оценихме както острия отговор на плацентите и плодовете към тази инжекция, така и дълготрайните ефекти на това приложение върху метаболитния фенотип на мъжкото и женското потомство. Въпреки че еднократното инжектиране на лептин не имитира нивата на лептин, които са характерни за затлъстяването, този модел ни позволява да оценим дали плодовете на 12-ия ден от развитието са чувствителни към действието на майчиния лептин и да разкрием остър отговор от страна на плодовете и плаценти. Установихме, че преходно повишаване на нивата на лептин в кръвта на женски мишки при GD12 засяга фенотипа на потомството и ефектът върху някои фенотипни признаци зависи от пола на потомството.

Установихме, че пренаталното излагане на лептин по време на средата на бременността не е предотвратило развитието на DIO, но е премахнало хипергликемията при затлъстели животни от двата пола. Предишно проучване показа, че хиперлептинемията по време на бременност подобрява глюкозния метаболизъм на потомството на DB/+ женски мишки [8]. Нашите резултати са в съответствие с тази констатация и предполагат, че специфичният период между 12 и 13 гестационен ден е критичен за развитието на системи за хомеостаза на глюкозата при потомството на мишки. При мишките пикът на пролиферация на родоначалници на активирани от хипоталамуса лептин неврони, които регулират енергийния баланс и глюкозната хомеостаза, настъпва на 12-ия ден [22, 23]. Доказано е, че лептинът насърчава миграцията и диференциацията на хипоталамусните невронни предшественици клетки [24]. Лептиновият рецептор Ob-Rb е открит в мозъка на фетуса на мишката от посткоиталния ден 10,5 [25]. Тези данни предполагат, че повишените нива на лептин по време на раждането на хипоталамусния неврон могат пряко да повлияят върху формирането на невронални системи, регулиращи енергийния баланс и глюкозната хомеостаза.

Според нашите предишни резултати [5], мъжкото потомство показва по-висока чувствителност към пренатална експозиция на лептин, отколкото чувствителността на женското потомство: мъжете, родени от лекувани с лептин майки, стават по-тежки от контролните мъже на възраст от 6 седмици поради ускорен темп на растеж след отбиване. Прилагането на лептин при женски мишки в края на бременността обаче има обратен ефект: намалява както приема на храна, така и BW на мъжкото потомство [5]. Хиперлептинемията по време на бременността също намалява BW на потомството на мишки [5, 7]. Тези открития предполагат, че действието за програмиране на лептин силно зависи от етапа на развитие на ембриона.

Ефектът от приложението на лептин върху растежа на плодовете вероятно се медиира чрез влиянието му върху плацентарните функции. По-рано в генетичния модел открихме, че повишеното ниво на лептин при A y мишки е придружено от намаляване на теглото както на плода, така и на плацентата [34] .

Интересното е, че при A y мишки повишените нива на лептин също са свързани с намалена експресия на Slc2a1 в плацентите само на женски плодове [34]. Взети заедно, нашите резултати показват, че повишаването на нивата на лептин в кръвта при мишки при секс в средата на бременността - специфично инхибира експресията на ген, кодиращ GLUT1 в плацентите. GLUT1 е най-често срещаният преносител на глюкоза в плацентата и регулира както усвояването на глюкозата от плацентата, така и трансплацентарния пренос на глюкоза към плода [39]. Влиянието на индуцираното от лептин инхибиране на Slc2a1 изразяването на плацентарния метаболизъм и трансплацентарния трансфер на глюкоза може да е причина за забавяне на растежа при женските плодове. Въпреки че лептинът играе важна роля във физиологията на плацентата [40], досега няма доказателства, че лептинът влияе върху експресията на Slc2a1 ген в плацентата. Влияние на лептина върху експресията на Slc2a1 генът в плацентите е възможно медииран от някои метаболитни сигнали, генерирани от язовири в отговор на приложението на лептин.

Прилагането на лептин инхибира растежа на плода, без да влияе върху плацентарната генна експресия на Igf1 и Igf2, за които е известно, че влияят върху растежа на плода и плацентарната морфогенеза, транспорта на субстрата и секрецията на хормони [41]. Пропорционалното намаляване на теглото както на мъжките плодове, така и на техните плаценти след приложение на лептин предполага, че намаляването на физическия размер на плацентите може да бъде основна причина за забавяне на растежа, предизвикано от лептин при мъжки плодове. Показани са различните ефекти на екзогенния лептин върху теглото на плацентите на мишки в зависимост от етапа на бременността и диетата на майката: лептинът намалява теглото на плода и плацентата при мишки при стандартна диета в края на бременността [32] и увеличава теглото на плацентата при мишки с ограничена храна в ранна бременност [42]. Нашите резултати са съгласни с наблюдението на Ямашита и др., въпреки че механизмите, лежащи в основата на влиянието на краткосрочното повишаване на лептина в майчината кръв върху плацентарното тегло, са неясни.

Благодарности

Искаме да благодарим на Александър Дзюбенко за помощта при създаването на графичен резюме на статията. Изследването е подкрепено от Руската фондация за фундаментални изследвания (проект 17‐04‐01357-а) и бюджетен проект 0259‐2019‐0002.

Конфликт на интереси

Авторите не декларират конфликт на интереси.