Жилианг Чен

1 Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Министерство на образованието и Министерство на опазването на околната среда и Държавна ключова лаборатория за здраве на околната среда (Инкубация), Училище за обществено здраве, Медицински колеж Тонджи, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китай

Börje Sellergren

2 Катедра по биомедицински науки, Факултет по здравеопазване и общество, Университет Малмьо, Малмьо, Швеция

Сиантао Шен

1 Ключова лаборатория за околна среда и здраве, Министерство на образованието и Министерство на опазването на околната среда и Държавна ключова лаборатория за здраве на околната среда (Инкубация), Училище за обществено здраве, Медицински колеж Тонджи, Университет за наука и технологии Huazhong, Ухан, Китай

Резюме

В тази работа разработихме ефективна стратегия за синергична катализа за „молекулярно отпечатани полимерни микрозими и неорганични магнитни нанозими“ за образуване на дисулфидни връзки в пептиди. Полимерните микрозими показаха отлична селективност спрямо пептида на матрицата, както и към основния реагент (линеен пептид), а нанозимите Fe3O4 магнитни наночастици (MNP) инхибираха междумолекулната реакция по време на образуването на дисулфидни връзки в пептидите. В резултат на това интегрирането на двата различни изкуствени ензима в един процес улеснява вътремолекулната циклизация при високи добиви на продукт (59,3%) с отлична селективност. Изследването на механизма показва, че синергичният ефект е настъпил чрез използване на стратегия за „обратен твърдофазен синтез“ с подобрено изместване на реакционния баланс към генерирането на продукта. Ние вярваме, че синергичната катализа от „полимерни микрозими и неорганични нанозими“, представена в настоящата работа, може да отвори нови възможности в създаването на многофункционални имитатори на ензими за усещане, изобразяване и доставка на лекарства.

Въведение

Като инхибиращ хормона на растежния хормон тетрадекапептид соматостатин (SST) е широко открит в телесните органи на животните (например в мозъчната тъкан, стомашно-чревния тракт и панкреаса; Brazeau et al., 1974). Поради наличието на дисулфидна връзка, SST е известен като по-стабилен богат на дисулфид цикличен пептид с разнообразни физиологични функции и медицински стойности от линейните пептиди (Ginj et al., 2006). Като цяло, SST може да инхибира секрецията на стомаха и панкреаса, да стимулира секрецията на слуз, да намали порталното венозно налягане, да отпусне жлъчния сфинктер, да облекчи ендотоксемията чрез стимулиране на мононуклеарната система на макрофагите, да инхибира освобождаването на тромбоцитен активиращ фактор, директно или индиректно да регулира цитокиновата верига защитават клетката (Hocart et al., 1998). Следователно изкуственият синтез на SST от химическата фабрика представлява особен интерес за фармацевтичните приложения (Wu et al., 2001).

Според литературата SST с дисулфидни мостове обикновено се синтезира чрез метод на течна фаза или метод на твърда фаза (Martín-Gago et al., 2014). И при двата метода последният етап е вътремолекулна циклизация на пептиди между двата стратегически избрани цистеинови остатъка (Cys). Въпреки това, общите методи за този последен етап (окисляването на Cys в дисулфидни мостове) претърпяват следния проблем: линейните пептиди лесно образуват странични продукти като димеризация или олигомеризация. За да се контролира процесът на окисление и по този начин да се получат желаните продукти, намаляването на концентрацията на линеен пептид и регулирането на условията на окисляване са основните методи за подобряване на добива от циклизацията на пептидите (Cheneval et al., 2014).

Намаляването на концентрацията на линеен пептид е ефективен начин за намаляване на генерирането на странични продукти. Този метод обаче също намалява количеството на продукта. Наскоро представихме система за междуфазна катализа, използваща молекулно отпечатани полимерни (MIP) микрогелове (MG), стабилизирани емулсии на Pickering. Тази емулсионна система на Pickering повишава производителността, като същевременно потиска образуването на странични продукти по време на синтеза на SST. MIP MG, които притежават кухини в полимерна матрица с афинитет към избрана молекула „шаблон“, селективно насърчават вътремолекулната циклизация на SST (Shen et al., 2016). В настоящата работа ще продължим да провеждаме вътремолекулна циклизация на пептидите в разтвора, като използваме отпечатаните MG като ензимни имитатори (полимерни микрозими). Освен потискането на образуването на страничен продукт, в тази работа ще бъдат представени още предимства при циклизирането на пептиди, използващи MIPs.

Регулирането на условията на окисление е вторият начин за намаляване на димеризацията или олигомеризацията на линейните пептиди по време на образуването на дисулфидни връзки. Традиционно въздух, калиев ферицианид, йод, водороден пероксид (H2O2), диметилсулфоксид (DMSO) и талиев трифлуороацетат често се използват като окислители по време на окисляването на Cys в дисулфидни мостове (Bulaj, 2005). Тези окислители обаче изглеждат много сурови в сравнение с естествените оксидази, въпреки че концентрацията на линейните пептиди е много ниска. Следователно, ензим миметичен нанокатализатор (нанозими), който може да осигури окислително състояние в сравнение с естествените оксидази, също ще бъде въведен при образуването на дисулфидни връзки в пептидите в настоящото проучване.

Вдъхновени от тези произведения, тук ще използваме пероксидаза-подобна активност на неорганичните Fe3O4 MNP, за да действа като нов пероксидазоподобен материал за циклизиране на линеен пептид. В сравнение с традиционните окислителни реагенти за образуване на дисулфиден мост, MNP нанозимите приличат повече на естествена оксидаза, а ензимоподобната окислителна реакция при почти физиологично състояние улеснява образуването на SST. От друга страна, окислителното състояние на L-SST е контролируемо, тъй като окислителната способност на системата зависи от адсорбцията на H2O2 върху MNPs.

Следователно в тази работа ще предложим нов метод за ниска цена и ефективна циклизация на SST чрез интегриране на MIP микрозими и MNP нанозими. Полимерните микрозими и неорганичните нанозими ще осигурят различни предимства за образуването на дисулфидни връзки на линейни пептиди. По време на циклизацията линейните пептиди се активират едновременно от два различни изкуствени ензима, за да проведат една химическа трансформация. Тази синергична катализа допълнително ще подобри реакционната активност и каталитичната селективност.

Материали и методи

Материали

Мономерите, N-изопропилакриламид (NIPAm), N-трет-бутилакриламид (TBA), акрилова киселина (AA) и N, N'-метилен бис (акриламид) (MBA), са закупени от Sigma-Aldrich. N, N, N ', N'-тетра-метил-етилендиамин (TEMED), амониев персулфат (APS) и дитиотреитол (DTT) се доставят от Sigma-Aldrich. FeCl3 • 6H2O, FeSO4 • H2O, NH3 • H2O (25%) и олеинова киселина са получени от Tianjing Chemical Reagent Company. SST (H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH, молекулно тегло: 1638) и неговата линейна структура (молекулно тегло: 1640) и десмопресин (Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2, молекулно тегло: 1 069) и неговата линейна структура (молекулно тегло: 1 071) е получен от WuHan Moon Biosciences Co., Ltd. Референтен соматостатин (rSST, Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr -Ser-Cys, молекулно тегло: 2375) също е получена от WuHan Moon Biosciences Co., Ltd. Други химикали са с реагент или по-висока степен.

Синтез на Fe3O4 MNPs (неорганични нанозими)

Неорганичните нанозими са получени по същия метод в предишната ни работа (Tang et al., 2012). Накратко, 4,86 ​​g FeCl3 • 6H2O и 3,34 g FeSO4 • 7H2O и 40 ml дестилирана вода се хомогенизират и се нагряват до 90 ° С. След добавяне на амониев хидроксид (12 ml) и олеинова киселина (0,8 ml), реакционната система се поставя при 90 ° С в продължение на 3 часа при магнитно разбъркване. Получените MNP с покритие с олеинова киселина се промиват съответно с етанол и дестилирана вода. Когато разтворът за измиване беше неутрално разделяне, MNPs бяха изсушени под вакуум в продължение на 24 часа. MNP се съхраняват в стъклена бутилка (която е покрита с алуминиева хартия, за да се избегне светлинно осветление).

Синтез на MIP микрогелове (полимерни микрозими)

Полимерните микрозими са синтезирани по същия метод, описан в предишната ни статия (Shen et al., 2016). Накратко, хомогенен разтвор първо се получава чрез смесване на 20,7 μL AA, 217,3 mg NIPAm, 61,0 mg TBA и 46,3 mg MBA, 6,8 mg SST шаблон и 20 ml PBS буфер (рН 7,4, 20 тМ) заедно. Частиците в реакционната система се отстраняват през филтър с 0.45 μm. След добавяне на 20 μL APS разтвор (10%) и отстраняване на О2 в системата чрез азотно барботиране, реакционната система се поставя при 50 ° С за 3 h под разклащане. Във втория етап в реакционния разтвор се добавят 120 μL APS разтвор (10%) и 60 μL TEMED. След завършване на добавката на инициатора, полимеризационната система отново се поставя при 50 ° С за 1 h под разклащане. Полимерните MG се пречистват чрез диализа, като се използват последователно 1 L чиста вода за 3 дни, 1 L вода, съдържаща 3 ml 4 M HCI за 3 дни, и 1 L чиста вода за 2 дни. Разтворът за измиване се сменя повече от четири пъти на ден.

Изтичането на целевия пептид от MIP MG се измерва при стайна температура чрез спектрофлуорометър (F-97 Pro, Shanghai Lengguang Technology Co. Ltd., Китай). Дължината на вълната на възбуждане и излъчване за SST са съответно 280 и 356 nm. Стъпката на измиване беше завършена, когато в супернатантата не беше измерен SST. Разтворът на MIP MG се разрежда с вода до 9.0 mg mL -1 (сух полимер) за по-нататъшно приложение. Разтворът NIP MG също е генериран при липса на шаблони по време на синтеза.

Характеризиране

Магнитното свойство на MNP нанозимите беше тествано с вибрационен магнитометър за проба (ADE 4HF VSM). Морфологията на полимерните MG се измерва чрез сканиращ електронен микроскоп (Inspect SEM F50, FEI Company). Разпределението на размера на MNP и мокрите MG беше оценено с помощта на динамично разсейване на светлината (DLS) с инструмент Coulter LS230 (Beckman-Coulter Co. Ltd.). Концентрацията на частиците както за MNP, така и за MG е ​​0,1 mg mL -1 по време на тестването.

Тест за подвързване и селективност

Способността за молекулярно разпознаване на MIP MGs беше изследвана също чрез инкубиране на полимерния MG разтвор (съдържащ 5.4 mg сухи MGs) и SST (с различни концентрации) в 1,5 ml Eppendorf епруветка. След 16-часова инкубация при стайна температура, полимерните MG се изолират чрез центрофугиране в продължение на 15 минути при скорост от 14 000 rpm. След това концентрацията на SST в супернатантата се анализира на спектрофлуорометър. Дължината на вълната на възбуждане и емисия е съответно 280 и 356 nm. Количеството SST, свързано с полимерния MGS, се изчислява от намаляването на интензивността на флуоресценцията в сравнение с разтвора преди свързването. Равновесната адсорбционна способност (qe, mg g -1) на SST от полимерните MG се изчислява чрез следното уравнение:

където C0 и Ce са равновесната концентрация на SST (mg mL -1) преди (първоначална) и съответно след адсорбцията. v и m са съответно обемът на разтвора на SST и масовото количество на сухите MG.

За да се тества селективността на MIP MG, беше изследвано свързването на референтни пептиди (включително L-SST, rSST, DDAVP и MSH). Концентрациите на L-SST, rSST и MSH бяха измерени, използвайки същия метод за SST. Концентрацията на DDAVP се определя с помощта на HPLC с диоден детектор (Chen et al., 2016). HPLC методът за DDAVP последва предишна работа (Christophersen et al., 2014).

Проучване на катализата

Резултати и дискусия

Характеристика на материалите

Утаяващата полимеризация с програмирана стратегия за смяна на инициатора беше ефективен начин за синтез на MIP MGs (Meng et al., 2009). Морфологията на сухите MG се наблюдава с помощта на сканиращ електронен микроскоп (SEM). На Фигура Фигура 1 се вижда, че сухите MIP и NIP MG са и два гелоподобни полимера. Използвайки измерванията на SEM и DLS, предишната ни работа показа, че MIP MG притежават сух диаметър

100 nm и мокър диаметър

280 nm, съответно. Ако предположим, че частиците са със сферична форма, коефициентът на набъбване на MIP MGs е

20. Този характер на силно подуване осигурява на MIP MGs достатъчно канали за пептидна дифузия.

синергична

SEM изображения на MIP MG а) и NIP MG б) излята върху стъклена пързалка.

Предишната ни работа показа, че MNP нанозимите варират от 10 до 20 nm чрез използване на TEM анализ (Tang et al., 2012). Тук това разпределение на размера беше потвърдено чрез измерване на DLS на фигура Фигура 2A 2A (

12 nm). Магнитните характеристики на MNP нанозимите са записани чрез VSM измерване. Вижда се на Фигура Фигура 2В 2В, че MNP нанозимите разкриват суперпарамагнитни дейности, стойностите на намагнитване на наситеността (Ms) за MNP нанозими е

60 ему g -1. Фигура Фигура 2C 2C демонстрира, че MNP нанозимите могат да бъдат леко изолирани от външно магнитно поле.

(А) DLS анализ на MNP нанозими в метанол; (Б) VSM измерване на MNP нанозими; (° С) Снимки на MNP нанозими, суспендирани във вода в отсъствие (вляво) и в присъствието (вдясно) на външно магнитно поле.

Свързващи профили на полимерни микрозими

Разпознаването на SST от полимерните микрозими беше изследвано чрез флуоресцентна спектрометрия. Фигура Фигура 3 3 показва свързващата изотерма на SST (от 15 до 120 μmol L -1) на MIP MG. Като контрол също беше извършена свързващата изотерма на SST върху NIP MGs и MNP нанозимите. Вижда се, че свързването на SST от нанозимите на MNP е пренебрегнато. И за двата полимерни MG, свързващият капацитет на SST се повишава с увеличаването на концентрацията на SST. Въпреки това, в сравнение с NIP MGs, MIP MGs показаха много повече поемане на шаблони.

Свързващи изотерми на SST върху MIP микрозими, NIP MG и MNP нанозими. Концентрацията на частиците е 5.4 mg mL -1 .

В предишната ни работа четири пептида, включително L-SST, референтен соматостатин (rSST), десмопресин (DDAVP) и меланоцит стимулиращ хормон (MSH) са избрани като референции за изследване на селективността на полимерните микрозими. Отбелязва се, че L-SST и rSST са аналозите на шаблона SST, докато DDAVP и MSH не са. Следователно, селекцията на четирите контролни пептида с различна структурна прилика е подходяща за изследване на селективността на разпознаване на MIP MGs. Експерименталните данни показват, че полимерните микрозими показват по-висок капацитет на свързване към SST, L-SST и rSST, отколкото NIP MGs. Тенденцията на селективността на полимерните микрозими беше в порядъка SST> L-SST> rSST> DDAVP> MSH, което може да се дължи на структурно сходство на тези пептиди (Shen et al., 2016). Отбелязва се, че полимерните микрозими също показват селективност към L-SST (основният реагент на продукта), който ще играе значителна роля по време на циклизацията на L-SST.

Изследване на синергична катализа

Синергичната катализа от „полимерни микрозими и неорганични нанозими“ беше проведена по отношение на дисулфидното образуване на линейни пептиди. Първо, образуването на странични продукти по време на циклизирането на линейни пептиди беше изследвано чрез MALDI анализ. В нашата предишна работа ние демонстрирахме, че смесените системи чрез добавяне на окислителния реагент към разтвора на L-SST в присъствието/отсъствието на полимерни MG показват високи добиви на пептиден димер (Shen et al., 2016). Това беше потвърдено и на фигура Фигура 4А 4А, когато H2O2 беше използван като окислителен реагент вместо йод (данните за чист H2O2, който беше същият като H2O2 + MIP микрозими, не бяха показани тук). Въпреки това, когато MNP нанозими бяха въведени в окислителната система, пептидните димери не бяха наблюдавани в системите на H2O2 + MNP нанозими (Фигура (Фигура4В) 4В) и H2O2 + MNP нанозими + MIP микрозими (Фигура (Фигура4C). 4C ). Отбелязва се, че пептидни димери не са открити и в системата от H2O2 + MNP нанозими + NIP MG (данните не са показани тук). Следователно заключаваме, че прилагането на MNP нанозими е ефективен начин за инхибиране на междумолекулната реакция по време на образуването на дисулфидни връзки в пептидите.

MALDI анализ на SST и страничните продукти след 30-минутна реакция за H2O2, (А) H2O2 + MNP нанозими, (Б) и H2O2 + MNP нанозими + MIP микрозими. (° С) Концентрацията на пептида във водната фаза е 120 μM. m/z 1639: SST + H +; m/z 1491: SST загуби Cys остатък; m/z 1660 и 1661: SST + Na +; m/z 3278: SST димер + Н + .

Времеви ход на концентрацията на L-SST (А) и кинетика на циклизация за L-SST (Б) в присъствието на MNP нанозими с или без полимерни микрозими. MNP нанозимите се добавят към полимерни микрозими след равновесно време от 30 минути. Константите на псевдо първи ред за нанозими H2O2 + MNP (1), нанозими H2O2 + MNP + NIP MG (2) и нанозими H2O2 + MNP + микрозими MIP (3) бяха 0,048, 0,058 и 0,084 минути -1, съответно.

Трето, беше изследван добивът на SST продукт от L-SST. Като контрола беше проучен и добивът на DDAVP продукт от линеен DDAVP (Таблица (Таблица 1). 1). За L-SST добивът на продукта за системата от H2O2 + MNP нанозими + MIP микрозими е бил 59.3%, което е много по-високо от системата от H2O2 + MNP нанозими + NIP микрозими (42.2%) и системата от H2O2 + MNP нанозими (35,6%). Въпреки това, когато Linear DDAVP се използва като линеен пептиден реагент, системата от H2O2 + MNP нанозими + MIP микрозими показва същия добив на продукт (без селективност) на H2O2 + MNP нанозими + NIP микрозими. Тези експериментални резултати показват, че отпечатаните кухини усилват селективно циклизацията на L-SST.