Резюме

Въведение

По този начин целта на това проучване е да се адаптира подходът на изотопния оборот на тъканите (MacAvoy et al., 2005; Abimorad et al., 2014) към урината на преживните животни и да се тества като неинвазивен, по-малко обезпокояващ прокси в дългосрочен план WBPT при относително голям брой говеда за угояване. В допълнение, ние също измерихме изотопния оборот на плазмените протеини като индикатор за степента на фракционен протеинов синтез (FSR) на плазмените протеини. Тъй като понастоящем няма наличен златен стандартен метод за измерване на WBPT в дългосрочен план (няколко месеца), ние оценихме този прокси, като оценихме способността му да открива различия между два хранителни фактора, за които е известно, че влияят върху обмена на протеини в цялото тяло в различна степен: i ) съдържанието и приема на протеини като силен и добре познат ефект (Waterlow, 2006) и ii) диетичният аминокиселинен профил като по-малко важен модулатор на скоростта на белтъчния оборот при говедата (Wessels et al., 1997). За тази цел измерихме кинетиката на азотното изотопно (δ 15 N) изчерпване в урините и плазмените протеини за период от 5 месеца след леко намаляване на δ 15 N от диетата при 36 угоени млади бикове, хранени с диети, формулирани на две различно съдържание на протеини и метионин. Предварителните резултати са публикувани като резюме (Cantalapiedra-Hijar et al., 2017).

скоростта

материали и методи

Експериментът е проведен в Herbipôle (Inra, UE 1414, Theix, Франция) в съответствие с националното законодателство за грижата за животните. Комитетът по етика на изследванията на животните C2EA-02 (Оверн, Франция) одобри в перспектива това изследване и след това Министерството на земеделието (Франция) го потвърди с номер на одобрение # 7180-2016101016361277v4.

Животни, диети и тест за ефективност

Тридесет и шест бика Charolais с угояване (320 ± 33 kg и 266 ± 22d) бяха разпределени към една от четирите експериментални диети (n = 9/лечение), произтичащи от факториален дизайн 2 × 2: две хранителни нива на метаболизиращи се протеини (100% [Нормално] срещу 120% [Високо] от изискванията; INRA, 2018), кръстосано с две диетични съдържания на метионин (небалансирана диета [2,0 g Met/100 g метаболизиращ се протеин] спрямо балансирана диета [2,6 g Met/100 g метаболизиращ се протеин]). Всички диети са изо-NE на кг DM и се състоят от около 54% ​​тревен силаж, 6% пшенична слама и 40% концентрат с количества, коригирани ежедневно, за да се осигурят поне 10% откази.

Диетичен изотопен N превключвател

Вземане на проби и 15 N анализ

Моделиране на скоростта на изотопния оборот и статистически анализ

Превключването след диета δ 15 N кинетика, измерена във всеки басейн (плазмен протеин и урина), беше внимателно анализирана съгласно Martinez del Rio и Carleton (2012) чрез тестване дали се подчиняват на първи или по-висок ред (2-ри ред) ) кинетика, съгласно следните моно- и биекспоненциални модели, съответно: където t (d) е времето от 15 N диетен превключвател, δ 15 N (t) (‰) е стойността на басейна δ 15 N във времето t, δ 15 N0 (‰) е началната стойност на басейна δ 15 N, а δ 15 N∞ (‰) е асимптотичната стойност на басейна, след като животното е достигнало изотопно стабилно състояние с основната си диета (без 15 N-урея администрация). В моноекспоненциалния модел k (d -1) е фракционната изотопна скорост на оборота на пула, докато при биекспоненциалния модел k1 и k2 (d -1) са две отделни фракционни изотопни скорости на оборот и p и ( 1-р) т съответния им принос към целия изотопен оборот.

За да диагностицираме дали моноекспоненциалният модел е достатъчен за адекватно приспособяване на кинетиката δ 15 N, използвахме подхода на променливата прогресия на реакцията ((Martinez del Rio and Carleton, 2012; Cerling et al., 2007), че се основава на пренареждането на уравнение [1], за да се получи: където (1-F) измерва оставащото δ 15 N разстояние до новото равновесие като дял от общото изотопно разстояние между първоначалното и асимптотичното δ 15 N, достигнато в равновесие. Както е показано в S1 Приложение, решихме какъв модел се изисква въз основа на визуална проверка на график от ln (1-F) спрямо времето, в зависимост от това дали ln (1-F) е намаляваща линейна функция на времето с наклон, равен на -k (моноекспоненциален модел) или последователност от 2 линии на все по-плитки склонове, равни на –k1 и –k2 (биекспоненциален модел). Този графичен анализ беше допълнително подкрепен от критерия Akaike Information, където по-ниските стойности показват превъзходство на един модел над друг.

Скорост на изотоп на урината

За δ 15 N кинетика в урините, подходът на реакцията ясно идентифицира два независими наклона с прекъсване между d4 и d7 (вложки на фигури 1 и 2). Това демонстрира съществуването на две различни скорости, бърза и бавна, на изчерпване на урината δ 15 N след превключване на диетата и обосновава необходимостта от биекспоненциален модел, който да отговаря адекватно на тези данни. Индивидуалната δ 15 N кинетика наистина е била правилно приспособена за почти всички животни (r2 ≥ 0,96; n = 34) с помощта на биекспоненциален модел, с изключение на 2 животни, които са били зле приспособени без видимо обяснение и поради това са били изключени от анализите . Когато всички данни бяха събрани и анализирани чрез биекспоненциален модел със смесен ефект, се наблюдаваше само значителен ефект от съдържанието на протеини в храната върху фракционните нива на 15 N-изчерпване в урините, където животните, хранени с високо протеинова диета, показаха по-високи стойности по време на както първият бърз (89,9 срещу 70,0%/d; P = 0,008), така и вторият бавен (10,3 срещу 8,01%/d; P 15 N оборот в сравнение с животни, хранени с нормални протеинови диети (фиг. 1). Без ефект на метионин съдържание е наблюдавано върху всеки параметър на модела (P> 0,10; Фигура 2).

В сравнение с животни, хранени с нормална протеинова диета (n = 17), животните, хранени с високо протеинова диета (n = 17), показват по-високи фракционни нива на изчерпване на 15 N урина по време на първото бързо (89,9 срещу 70,0%/d; P = 0,008 ) и втората бавна (10,3 срещу 8,01%/d; P 15 N-кинетика на изчерпване в урината изисква биекспоненциален модел с две скорости за две - бърза и бавна - фази (Martinez del Rio и Carleton, 2012). разликите в параметрите на модела между леченията са изобразени със звезди (** P Кинетика на 15 N-изчерпване в урината след 15 N диетичен превключвател (вж. Материал и методи) при бикове за угояване на Шароле, хранени или балансирано (тънка линия), или небалансирано (дебело) диета по отношение на съдържанието на метионин. В сравнение с животни, хранени с диети, небалансирани с метионин (n = 17), животните, хранени с диети, балансирани с метионин (n = 17), показват сходни фракционни нива на N-изчерпване на урината 15 по време на първото бързо ( 80,0%/d; P = 0,92) и втората бавна (9,10%/d; P = 0,80) фази. Inset представлява повторната подход за променлива действие-прогрес [ln (1-F); вж. Материали и методи] за диагностициране, че адекватното приспособяване на 15 N кинетиката на изчерпване в урината изисква биекспоненциален модел с две скорости за две - бърза и бавна фази (Martinez del Rio и Carleton, 2012).

В сравнение с животни, хранени с диети, небалансирани с метионин (n = 17), животните, хранени с диети, балансирани с метионин (n = 17), показват сходни фракционни нива на N-изчерпване на урината 15 по време на първото бързо (80,0%/d; P = 0,92) и втората бавна (9,10%/d; P = 0,80) фази. Inset представлява подход на променлива реакция-прогрес [ln (1-F); вж. Материали и методи] за диагностициране, че адекватното приспособяване на 15 N кинетиката на изчерпване в урината изисква биекспоненциален модел с две скорости за две - бърза и бавна фази (Martinez del Rio и Carleton, 2012).

Скорост на плазмен изотопен оборот

За δ 15 N кинетика в плазмените протеини, подходът на хода на реакцията показва един наклон (вложки на фигури 3 и 4). Това демонстрира съществуването на единична, хомогенна скорост на изчерпване на δ 15 N в плазмените протеини след превключване на диетата и оправдава, че моноекспоненциалният модел е достатъчен, за да се съобразят адекватно тези данни. Индивидуалните δ 15 N кинетики в плазмените протеини наистина са били правилно пригодени (r2 ≥ 0,98; n = 36) чрез моноекспоненциален асимптотичен модел. Когато всички данни бяха събрани и анализирани чрез асимптотичен модел със смесен ефект, бяха наблюдавани по-ниски стойности на плазмените протеини δ 15 N при животни, хранени с високо в сравнение с нормални протеинови диети (фиг. 3) през първия ден (d0; P = 0,04) и в равновесие (d142; P = 0,09). За разлика от това, ефектът от балансирането на диетите по отношение на съдържанието на метионин има тенденция (P = 0,09) да има по-висока стойност на δ 15 N в плазмените протеини върху d0 (Фигура 4), но не и в равновесие (P = 0,47). Фракционната скорост на 15 N-изчерпване в плазмените протеини е по-висока при животни, хранени с високо в сравнение с нормални протеинови диети (4.42 срещу 4.08%/d; P = 0.02) и при хранени диети, балансирани в сравнение с небалансирани в метионин (4.38 срещу 4.10%/d; P = 0,05).

В сравнение с животни, хранени с небалансирана диета с метионин (n = 18), животните, хранени с диети, балансирани с метионин (n = 18), показват по-високи стойности на плазмените протеини δ 15 N в момент 0 (15,9 срещу 15,0 ‰; P = 0,05) и по-висока фракционна скорост на плазмените протеини 15 N-изчерпване (4.38 срещу 4.10%/ден; P = 0.05). Inset представлява подход на променлива реакция-прогрес [ln (1-F); вж. Материали и методи], диагностициращ, че моноекспоненциалният модел е достатъчен, за да отговаря адекватно на 15 N кинетиката на изчерпване в плазмените протеини (Martinez del Rio и Carleton, 2012). Значителни разлики в параметрите на модела между леченията са изобразени със символи († P 15 N-изчерпани след изотопна диета превключвател представляват неинвазивни (или по-малко инвазивни) проксита на дългосрочните WBPT и плазмения протеин FSR, съответно. да бъдат много полезни за бъдещи проучвания относно ефективността на фуражите (оборот на протеини като енергоемък процес), устойчивост на животните (оборот на протеини като услуга за поддръжка) и качество на месото (in vivo оборот на протеини, свързан със скоростта на следкланична протеолиза и по този начин на месо нежност), извършена върху голям брой животни.

Биологично значение на изотопните обороти

Простотата на метода, описан тук, може да контрастира с необходимостта да се обърне внимание на някои методологични съображения за интерпретиране на нашите резултати. Скоростта, с която тъканите на животните ще включват изотопния подпис на новата диета, изглежда се определя най-вече от тяхната скорост на белтъчен оборот, според много предишни доклади (Carleton and Martinez del Rio, 2005; MacAvoy et al., 2005; Braun et al., 2013). Нещо повече, това е потвърдено от механистични модели (Martinez del Rio и Carleton, 2012; Poupin et al., 2012), демонстриращи, че основният двигател, определящ степента на усвояване на новата хранителна стойност δ 15 N в тъкан след диета -switch е протеинът FSR на тази тъкан. По този начин скоростта на изотопния оборот, която открихме в плазмения пул протеин (т.е. параметърът на модела k; Фигури 3 и 4), представляваше собствения си FSR (т.е. сумата от неговата степен на фракционно разграждане и скорост на фракционен растеж) и може да бъде предложена като начин за индиректно оценяване на FSR на черния дроб на плазмените протеини. За разлика от това, доколкото ни е известно, степента на изотопния оборот на урината никога не е била анализирана механично и, както се обсъжда по-нататък, нейното биологично значение се приписва най-вече на WBPT. Някои съображения и предположения обаче трябва да бъдат обсъдени в подкрепа на нашата биологична интерпретация.

За онези уринарни азотни съединения, които не са свързани с окислението на АА и са с преживен произход (предимно пуринови производни [алантоин и пикочна киселина], хипурова киселина и амоняк на рубея, най-вече трансформирани в карбамид), може да се твърди, както вече споменахме, че вероятно въздействие върху първата бърза фаза на скоростта на изчерпване на 15 N урина (k1), но докато плазмената абсорбция на такива съединения остава относително постоянна във времето, те няма да имат ефект върху втората бавна фаза на това изчерпване (k2). Като вземем всичко това заедно, можем да помислим, че дори k2 да не отговаря стриктно само на WBPT, той може да отразява количествено този поток и може да бъде предложен като прокси за неговото оценяване.

И накрая, ние признаваме, че предложеният подход, основан на скоростта на изотопно разпадане, може да бъде проблематичен за реална и точна оценка на WBPT поради феномена на повторно използване на аминокиселини (т.е. повторно включване на белязани аминокиселини, освободени от разграждането на протеина по време на възстановяването на протеините синтез). Всъщност, тъй като общите темпове на белтъчен оборот значително надвишават нивата на диетичен прием на протеини, голяма част от аминокиселинните субстрати за протеинов синтез произтичат от разграждането на протеините (Lobley, 2000). Въпреки това, дори ако повторното използване на АА може да повлияе на стойностите на 15N във всяка времева точка на изотопния разпад, ние приемаме, че по-високият белтъчен оборот (свързан и с по-високото повторно използване на АА) винаги ще има по-висок k2 от ниския белтъчен оборот. По този начин, за сравняване на леченията (или дори на индивидите) по отношение на WBPT, този подход все още може да служи като прокси.

За да оценим гореспоменатите биологични интерпретации, тествахме способността на нашия метод да открива разликите между два диетични фактора, съдържанието на протеин (Нормално срещу Високо) и АА профила (диети, балансирани спрямо небалансирани в метионин), за които е известно, че влияят върху протеина на цялото тяло темп на оборот в различна степен.

Скорости на изотопен обмен по диетични фактори, влияещи върху метаболизма на протеините

Също така установихме, че скоростта на 15-изчерпване на N на плазмения протеин (k) се увеличава с диетичното съдържание на протеини, подкрепяйки идеята за по-голям метаболизъм на протеини на всички телесни нива, както се разкрива чрез анализа на урините. По същия начин, Tsahar et al. (2008) също откриват при птици, че скоростта на обмен на 15 N в плазмата се е удвоила (от около 11 на 20%/ден), когато диетичният протеин се измести от 7 на 16% CP. Влиянието на съдържанието на диетични протеини върху скоростта на белтъчния оборот на плазмените протеини е демонстрирано през 50-те години чрез елегантното проучване на Steinbock and Tarver (1954), които инжектират в плъхове плазма от донори плъхове, при които протеините преди това са били маркирани с [35 S] метионин. Този ефект обаче не се наблюдава при преживните животни чрез стандартни изотопни методи, при които плазмените протеини FSR остават непроменени при млечни крави, хранени с различно съдържание на метаболизиращ се протеин (Raggio et al., 2007) или овце, претърпели смяна между състоянието на гладно и хранене (Connell и др., 1997).

От друга страна, не са открити промени в скоростта, с която урините постепенно се изчерпват за 15 N след изотопно превключване на диетата между небалансирани и балансирани диети по отношение на съдържанието на метионин. За разлика от това, скоростта на N-изчерпване на 15 плазмени протеини е леко увеличена, което показва, че FSR на протеина е подобрен за плазмените протеини и вероятно също така и на други различни телесни нива. Нашите открития могат да покажат, че наблюдаваната тенденция за балансирани диети Met за подобряване на производителността на месодайните говеда, наблюдавана в този експеримент (Cantalapiedra-Hijar et al., 2017) и други (Wessels et al., 1997), може да произтича от повишен протеин в цялото тяло синтез, а не намаляване на разграждането на протеините в цялото тяло.

Заключения

Ние вярваме, че скоростта, с която урината на животните се изчерпва с 15 N след спиране на прилагането на 15 N белязана урея в диетата (т.е. степента на изотопния оборот след смяна на диетата), може да бъде предложена като неинвазивен и прост прокси за оценка в дългосрочен процент на обмен на протеин в цялото тяло при голям брой животни. Необходими са по-нататъшни проучвания за изследване на потенциала и границите на този нов обещаващ изотопен подход за оценка на белтъчния оборот. По-конкретно, бъдещите работи трябва да оценят въздействието на повторното използване на АА и рециклирането на урея-N върху N изотопната динамика в урината и тъканите след смяна на диетата.

Подкрепяща информация

A) Моноекспоненциален модел (като при плазмените протеини), където δ 15 N кинетика е подходящо монтирана според δ 15 N (t) = δ 15 N∞ + (δ 15 N0 - δ 15 N∞) × e −k × t и се отбелязва единичен наклон, когато логаритъмът на променливата на хода на реакцията (1-F = (δ 15 N (t) - δ 15 N∞)/(δ 15 N0 - δ 15 N∞)) се регресира навреме. Б) Двуекспоненциален модел (като при уриниране), където δ 15 N кинетика е подходящо монтирана според δ 15 N (t) = δ 15 N∞ + (δ 15 N0 - δ 15 N∞) × [p × e −k1 × t + (1-p) × e −k2 × t] и се отбелязват два различни наклона, когато логаритъмът на променливите на хода на реакцията се регресира навреме. Двата различни наклона представляват степента на частичен оборот по време на първата преходна (k1) и втората трайна (k2) фази, съответно.

Благодарности

Авторите благодарят на Винсънт Лардо и екипа на Herbipôle за тяхната голяма техническа помощ по време на този експеримент. Фазовият отдел на INRA е признат за подпомагане на пилотното проучване, което служи за установяване на условията на представения тук експеримент.