Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция

Институт по молекулярна биология Енгелхард, Руската академия на науките, 119991 Москва, Русия

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция

Институт по молекулярна биология Енгелхард, Руската академия на науките, 119991 Москва, Русия

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция

Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция

  • Стефани Кервестин 1, ‡,
  • Людмила Фролова 2, ‡,
  • Лев Киселев 1 и
  • Оливие Жан-Жан 1
  • 1 Unité de Biochimie Cellulaire, CNRS FRE 2219, Université Pierre et Marie Curie, 9 quai Saint-Bernard, 75005 Париж, Франция
  • 2 Институт по молекулярна биология Енгелхард, Руската академия на науките, 119991 Москва, Русия
  • ‡ С. Кервестин и Л. Фролова допринесоха еднакво за тази работа

*Автора за кореспонденция. Тел: +7 95 1356009; Факс: +7 95 1351405; Имейл: [имейл защитен]

При еукариотите полипептидният фактор на освобождаване 1 (eRF1) участва в прекратяването на транслацията при всичките три стоп кодона. Механизмът за декодиране на стоп кодоните обаче остава неизвестен. Постулирано е директно взаимодействие на eRF1 със стоп кодоните. Последните проучвания се фокусират върху eRF1 от ресничките, при които някои стоп-кодони са преназначени да усещат кодони. Използване на инвитро анализ, базиран на рибозоми на бозайници, показваме, че eRF1 от ресничестите Euplotes aediculatus реагира на UAA и UAG като стоп кодони и няма способността да дешифрира UGA кодона, който кодира цистеин в този организъм. Този резултат категорично предполага, че при ресничките с варианти на генетични кодове eRF1 не разпознава преназначените кодони. Последните хипотези, описващи дискриминацията на стоп-кодон от eRF1, не са напълно съвместими с набора от eRF1 последователности, налични до момента и изискват директно експериментално тестване.

Въведение

Прекратяването на протеиновия синтез се регулира от наличието на стоп кодон в мястото на рибозома А и от факторите за освобождаване на полипептидната верига (RFs) (прегледано от Kisselev and Buckingham, 2000). При еукариотите един фактор, eRF1, декодира и трите стоп кодона, UAA, UAG и UGA, докато при прокариотите RF1 отговаря на UAA и UAG, докато RF2 отговаря на UAA и UGA.

Нито една от хипотезите, постулиращи механизма на декодиране на терминиращите кодони, не е доказана директно. Предполага се, че стоп кодоните в рамките на рибозомата се разпознават по фактори за прекратяване клас-1 RF1, RF2 и eRF1 (вж. Nakamura и др., 2000). Основният аргумент е много тесният контакт между RF-1 клас и стоп-кодоните в рибозомата, разкрит чрез фото крослинкинг както при прокариоти (Brown and Tate, 1994; Poole и др., 1997) и еукариоти (Chavatte и др., 2001). Друг аргумент идва от експерименти, показващи, че мутагенезата на RF-1 последователности от клас 1 е довела до модификация на техния модел за разпознаване на стоп кодони (Bertram и др., 2000; Ито и др., 2000). Като алтернатива беше предложено стоп кодоните да могат да бъдат разпознати по специфични последователности в рибозомните РНК (вж. Арков и Мургола, 1999; Иванов и др., 2001).

Забележителна черта на някои ресничести видове е използването на алтернативни ядрени генетични кодове, които е възможно да са възникнали независимо, дори в рамките на един клас реснички (Baroin-Tourancheau и др., 1995). Известните промени се отнасят до преназначаването на стоп-кодони към усещащи кодони. Например, Тетрахимена и Парамеций, и хипотрихите Stylonychia и Oxytricha, превежда UAA и UAG като глутамин, като UGA е единственият стоп кодон, докато хипотрихът Евплот превежда UGA като цистеин и използва UAA и UAG като стоп кодони (за преглед вж. Lozupone и др., 2001). Предполага се, че в допълнение към промените в tRNAs, преназначаването на стоп кодон трябва да включва промени в структурата на eRF1. Бяха положени значителни усилия за последователност eRF1 гени от ресничести видове с варианти на генетични кодове (Karamyshev и др., 1999; Инагаки и Дулитъл, 2001; Лианг и др., 2001; Лозупоне и др., 2001). Във връзка с хипотезата, че N-терминалният домейн на eRF1 е замесен в разпознаването на стоп-кодон (Bertram и др., 2000), многобройни последователни подравнения бяха анализирани в опит да се предскаже кои аминокиселини на eRF1 участват в разпознаването на стоп кодон. Въпреки това, в зависимост от броя на използваните eRF1 последователности, бяха избрани различни групи аминокиселинни остатъци от N-терминалния домен (Lehman, 2001; Lozupone и др., 2001; Мурамацу и др., 2001).

В това проучване проверихме предположението, че eRF1 от ресничка с вариант на генетичен код не разпознава преназначения стоп кодон. Нашите резултати показват това Евплот eRF1 не реагира на UGA, който се използва като цистеинов кодон в този организъм. Ние също така показваме, че въвеждането на нови eRF1 последователности в подравняването на eRF1 постави под съмнение повечето от последните хипотези относно разпознаването на стоп кодони при еукариотите.

Резултати

Изолация на Euplotes aediculatus ген, кодиращ eRF1

Освобождаване на Евплот eRF1 инвитро

Освобождаващата активност на пречистения човек и Евплот eRF1 (ЕС‐ERF1) е измерен с трите стоп-кодона и почти роднински триптофан UGG кодон в инвитро RF анализ. Както е известно от предишно проучване (Frolova и др., 1994), човешкият eRF1 в дадената система за анализ реагира на трите стоп кодона (Таблица 1). Въпреки това, при същите условия, ЕС‐ERF1 реагира само на UAA и UAG, но не и на UGA, който кодира цистеин в Евплот. Не се наблюдава активност със смисловия UGG кодон, като и двата фактора (Таблица 1) показват поддържането на дискриминираща способност на ЕС‐ERF1 и човешки eRF1 към почти роднински кодон. Както в случая с гръбначни eRF1 (Frolova и др., 1994; Журавлева и др., 1995), ЕС‐ERF1 беше активен без eRF3 и GTP, потвърждавайки заключението, че тези компоненти не са замесени в хидролизата на пептидил-тРНК. При заешките рибозоми активността на освобождаване на ЕС‐ERF1 е малко по-нисък от този на човешкия eRF1 (Таблица 1). Тази незначителна разлика може да бъде свързана с използването на хетероложна система, в която годността на ЕС‐ERF1 за рибозомата на бозайниците може да не е напълно съвършен.

eRF1 f [35 S] Met освободен, c.p.m. UGAA UAGA UAAA UGGA
Опит.1 Човек 5590 4640 5120 0
Евплот 0 3050 4030 0
Опит.2 Човек 9440 6420 7920 0
Евплот 0 3200 4580 0
  • Количеството f [35 S] Met, отделено в отсъствието на тетраплет (фон 500–800 c.p.m.) се изважда от всички стойности. Експерименти 1 и 2 бяха проведени с различни f [35 S] Met-tRNA препарати. Във всеки от тези експерименти е представена средна стойност от три независими измервания. Стандартното отклонение на измерванията е 11%.

Дискусия

Човешките и жабешките eRF1 разпознават и трите стоп-кодона и ги дискриминират от почти роднинския UGG кодон без други фактори и GTP в инвитро система за прекратяване на транслацията с рибозомни субединици, свързани с заек (Frolova и др., 1994). Засега обаче няма налични данни относно специфичността на стоп-кодона на eRF1 от организми с варианти на генетични кодове. При тези организми преназначаването на стоп кодон в смислов кодон се управлява или единствено от супресорна подобна тРНК, съдържаща сроден антикодон, или от едновременното присъствие на сродна тРНК и модифициран eRF1, който е загубил способността си да разпознава преназначения стоп кодон или дори от рибозомата самостоятелно. В първия случай, поради конкуренцията между супресорни тРНК, способни да дешифрират стоп кодон и eRF1 (Drugeon и др., 1997; Льо Гоф и др., 1997), синтезът на протеини с пълна дължина изисква голямо изобилие на супресорната тРНК и намалено количество eRF1. В последния един от компонентите на рибозомата трябва да участва в разпознаването на стоп кодон.

За да разграничим тези възможности сме комбинирали инвитро рибозоми на бозайници с eRF1 от E. aediculatus в който UGA кодира цистеин и само UAA и UAG остават като терминационни сигнали. По този начин разгледахме въпроса дали два или три кодона ще бъдат декодирани в тази хетероложна система. Резултатите от таблица 1 показват, че UGA не се декодира като стоп кодон от ЕС‐ERF1 в тази система, демонстрирайки това Евплот eRF1 е загубил способността си да реагира на преназначения UGA и че преназначаването на UGA не се медиира от tRNA, конкурираща се с eRF1 в рамките на рибозомата. Нещо повече, тези резултати също доказват, че специфичността на стоп кодона се разкрива от терминационния фактор, а не от самата рибозома или рибозомни компоненти. Способността на ЕС‐ERF1 да функционира в рибозома на бозайници предполага, че въпреки голямото разминаване в последователността между eRF1 от организми с канонични и разновидни генетични кодове, местата за свързване на рибозомите на eRF1 са добре запазени и позволяват кръстосана реактивност на рибозомите и факторите от еволюционно отдалечени видове.

N-терминалният домейн на eRF1 вероятно имитира антикодоновото рамо на tRNA (Song и др., 2000). Ако е така, може да се постулира модел за разпознаване на „протеинов антикодон“ като начин за декодиране на стоп кодони (Ito и др., 2000; Накамура и др., 2000). Бертрам и др. (2000) идентифицират мутации в дрожди eRF1, които увеличават потискането на UAG или UGA. Всички мутации са локализирани в N-крайния домейн на eRF1, потвърждавайки, че този домейн е отговорен за дискриминацията на стоп кодоните. След това предизвикателството беше да се идентифицират аминокиселините на eRF1, взаимодействащи със стоп кодона, подобно на това, което беше демонстрирано за бактериални RF-1 RF (Ito и др., 2000). Стратегията се основава на данните за кристалната структура на eRF1 и на сравнението на множество последователности на eRF1 от силно различаващи се еукариотни видове, включително тези от ресничките (Фигура 1). Предполагаше се, че промените в употребата на стоп-кодон са медиирани от аминокиселините на eRF1, взаимодействащи със стоп-кодоните. Счита се, че запазеният мотив на NIKS (позиции 61–64) участва в разпознаването на стоп кодони (Knight and Landweber, 2000). Това предположение беше изоставено, когато в eRF1 последователности от Stylonichia и Oxytricha, две реснички, използващи същия вариант на генетичен код като Tetrahymena thermophila, NIKS (не NIKD, както в T. thermophila) е идентифициран мотив (Lozupone и др., 2001).

кодон

В предполагаемия „протеинов антикодон“ регион някои остатъци в eRFs се запазват във всички еукариоти, с изключение на ресничките, където UAR кодоните кодират глутамин, т.е. I35V, M51L и L126F (Lozupone и др., 2001) и L126I през Евплот, където UGA кодира цистеин (Фигура 1). Фактът, че остатъците 35 и 126 са близо един до друг в пространствената структура (Песен и др., 2000) е в съответствие с потенциалното им участие в разпознаването на стоп кодони (Lehman, 2001). Въпреки това, eRF1 последователността на микроспоридиите Encephalitozoon cuniculi, който използва каноничен генетичен код, има метионин в позиция 126 (Фигура 1). Как може тази промяна да бъде приспособена с описания по-горе модел?

Мурамацу и др. (2001) предложи E55, G57/T58 и S60/N61 да разпознаят съответно първата, втората и третата база на стоп кодоните. Секвенирахме eRF1 ген от P. tetraurelia (S. Kervestin, непубликуван) и подравняването на тази последователност с другите eRF1 (Фигура 1) показва, че различията, наблюдавани в позиции 55, 57, 58 и 60, не се вписват добре с този модел. Например в Тетрахимена, Stylonichia и Oxytricha, позиция 57 е заета от серин, докато Парамеций eRF1 има аланин в това положение. Тези замествания не са свързани с преназначаване на кодон в ресничести eRF1s в сравнение с eRF1s от организми с универсален генетичен код. Ciliate eRF1s показват висока еволюционна скорост, което се отразява в увеличен брой променливи позиции (Inagaki и Doolittle, 2001; Дейвид Морейра, лична комуникация). По този начин не може да се изключи, че или остатъците от eRF1, участващи в разпознаването на стоп-кодон, могат да заемат различни променливи позиции в ресничести последователности, или променливи позиции модифицират функционалните ограничения на няколко фиксирани позиции. Допълнителни eRF1 последователности, особено от ресничести видове, биха могли да помогнат за избора на аминокиселини, замесени в разпознаването на стоп кодон.

Нашите данни за неспособност на ЕС‐RF1, за да отговори на UGA, силно подкрепя предположенията, че (i) във всички реснички с варианти на генетични кодове eRF1 не реагира на преназначени стоп кодони; (ii) в тези организми модификациите на аминокиселинните последователности на eRF1 са отговорни за модела на разпознаване на стоп кодон; и (iii) вероятно рибозомите от инфузории притежават същата способност да поддържат прекратяването на трите стоп-кодона като рибозомите от организми с конвенционален генетичен код.

Методи

Плазмиди, скрининг в библиотека, генни манипулации, ДНК секвениране и PCR амплификация.

The E. aediculatus eRF1 ген (Фигура 2) е изолиран от макронуклеарна ДНК pUC18 библиотека, предоставена от A. Baroin-Tourancheau (Université Paris-Sud). Тъй като eRF1s на ресничките се различават силно от други еукариоти, кодиращата последователност на eRF1 от P. tetraurelia (S. Kervestin, непубликуван) е използван като сонда за скрининг на библиотеки. Скринингът в библиотеката и манипулациите с гени се извършват по стандартните процедури (Sambrook и др., 1989). Бактериалните колонии, прехвърлени на филтри Hybond N + (Amersham-Pharmacia Biotech.), Бяха открити чрез хибридизация при не-строги условия (1 h при 60 ° C, последвано от бавно охлаждане до 30 ° C) и промиване в 2 × SSC (0,3 M NaCl, 30 mM натриев цитрат) плюс 0,1% SDS при 35 ° C. Цялата нуклеотидна последователност на вложките беше определена и за двете вериги. PCR амплификации на ДНК се провеждат в 25 μl реакционни смеси, съдържащи 1 ng плазмидна ДНК, 100 pmol от всеки праймер, 200 μM всеки дезоксинуклеозид трифосфат, 1 × търговски PCR буфер и 2,5 U Pwo ДНК полимераза (Roche). Усилвателите се провеждаха в продължение на 20 цикъла (94 ° C, 30 s; 50 ° C, 30 s; 72 ° C, 1 min) в термоциклер.

Сайт-насочена мутагенеза.

Това беше извършено, за да се трансформират четири в рамка UGA кодони на E. aediculatus eRF1 ген в каноничния цистеинов UGC кодон с помощта на насочен към сайта мутагенезен комплект за трансформатор (Clontech). Получената модификация eRF1 След това ДНК (от кода за иницииране на AUG до последния кодон) се усилва чрез PCR с подходящи олигонуклеотиди, съдържащи рестрикционни места (Ndeаз и ХиндIII) за директно клониране в pET21b (Novagen). Финалната конструкция, наречена pET‐ЕС‐RF1 ‐ His6, съдържа се E. aediculatus eRF1 ORF под контрол на Т7 промотор.

Експресия и пречистване на eRF1s.

беше вмъкната cDNA, кодираща човешкия eRF1 с пълна дължина NdeI–XhoI сайтове на pET23b (+) (Novagen). ЕС‐ERF1 и човешки eRF1, съдържащи His-таг в С-края, бяха изразени в Ешерихия коли щам BL21 (DE3) и пречистен с помощта на Ni-NTA смола, Superflow (Qiagen), както е описано (Frolova и др., 1994, 2000).

Рибозоми.

Заешките ретикулоцитни рибозомни субединици са любезно предоставени от P. Simonenko (Институт за изследване на протеини, Пушино). 80S рибозоми, промити с 0,5 M KCl, бяха третирани с пуромицин и GTP за дисоциация в субединици, които впоследствие бяха разделени чрез центрофугиране в 10-25% (w/v) градиент на захароза, съдържащ 0,3 M KCl, 3 mM MgCl2, 1 mM дитиотреитол 20 mM Tris – HCl рН 7,6. Преди добавяне към инкубационните смеси, субединиците се комбинират в еквимоларно съотношение.

Инвитро RF анализ.

Активността на eRF1 се измерва, както е описано (Caskey и др., 1974; Фролова и др., 1994) при нива на насищане (50 μM) на един от трите тетраплети, съдържащи стоп-кодон или UGGA тетраплет, съдържащ кодон за триптофан. Инкубационната смес (25 μl) съдържа 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 15 mM MgCl2, 8 mM NH4Cl, 1,5 pmol f [35 S] -Met-tRNAf Met –AUG – рибозомен комплекс и eRF1 (0,2–0,3 μg). AUG и риботетраплетите са синтезирани от А. Вениаминова и М. Рябкова (Институт по биоорганична химия, Новосибирск).