Институт за биологични прибори на Руската академия на науките, 142292 Пущино, Московска област, Русия

лакталбумина

Катедра по химия, Държавният университет в Охайо, Колумб, OH 43210, САЩ

Институт за биологични прибори на Руската академия на науките, 142292 Пущино, Московска област, Русия

Катедра по химия, Държавният университет в Охайо, Колумб, OH 43210, САЩ

Резюме

Малкият млечен протеин α-лакталбумин (α-LA), компонент на лактозната синтаза, е прост модел на свързващ протеин Ca 2+, който не принадлежи към EF-ръчните протеини, и класически пример за разтопено кълбо състояние. Той има силно място за свързване на Ca 2+, което свързва Mg 2+, Mn 2+, Na + и K + и няколко отделни места за свързване на Zn 2+. Свързването на катиони към мястото на Са 2+ повишава стабилността на протеина срещу действието на топлина и различни денатуриращи агенти, докато свързването на Zn 2+ към натоварения с Са 2+ протеин намалява неговата стабилност. Функционирането на α-LA изисква неговите взаимодействия с мембрани, протеини, пептиди и субстрати и продукти с ниско молекулно тегло. Показано е, че тези взаимодействия се модулират чрез свързването на метални катиони. Наскоро беше установено, че някои сгъваеми варианти на α-LA демонстрират бактерицидна активност и някои от тях причиняват апоптоза на туморни клетки.

1. Въведение

Второ, α-LA притежава единствен силен Ca 2+ свързващ сайт [2, 3] и поради тази причина той често се използва като прост, моделен Ca 2+ свързващ протеин. Много е удобен за изследване на ефектите на свързване на калция върху взаимодействията на протеина с протеини, пептиди, мембрани и органични съединения с ниско молекулно тегло, които често имат физиологично значение.

Трето, α-LA има няколко частично сгънати междинни състояния, които се изследват от много изследователи, интересуващи се от проблемите на сгъване на протеини. Той е много привлекателен за изследване на свойствата и структурата на междинни стопени глобулоподобни състояния, тъй като при киселинно рН и в апо-състояние при повишени температури α-LA е класическата „стопена глобула“ [3-5] .

Четвърто, беше установено наскоро, че някои форми на α-LA могат да индуцират апоптоза в туморните клетки [6, 7], което предполага, че този протеин може да изпълнява много важни биологични функции.

2 Първична, вторична и третична структура

3 Местоположение на местата за свързване на катиони

Една от най-интересните характеристики на α-LA е способността му да свързва метални катиони. Той не принадлежи към семейството на протеини EF-ръка. Протеинът има едно силно място за свързване на калций, което се образува от кислородни лиганди от карбоксилни групи от три Asp остатъка (82, 87 и 88) и две карбонилни групи на пептидния скелет (79 и 84) в цикъл между две спирали. Цикълът съдържа два остатъка по-малко от типичния EF-ръка Ca 2+ свързващ домейн. Освен това една или две водни молекули участват в директната координация на Ca 2+. Като цяло кислородните лиганди образуват изкривена петоъгълна бипирамидна структура. Наскоро беше открито вторично място за свързване с калций чрез рентгенова кристалография, разкрито в човешкото α-LA 7,9 Å далеч от първичното място за силно свързване с калций [12]. Четири остатъка участват в координацията на Ca 2+ на това място в тетраедрично разположение (Thr-38, Gln-39, Asp-83 и карбонилният кислород на Leu-81). Това вторично място се намира близо до повърхността на молекулата α-LA.

4 Индуцирани от калция промени в конформацията

Свързването на Ca 2+ с α-LA причинява изразени промени в структурата и функцията, най-вече във висшата, но не и в вторичната структура, което се вижда ясно както от флуоресценцията [3, 19], така и от CD [20] данните. Калциевото свързване води както до промяна в синята флуоресценция на триптофан, така и до намаляване на квантовия добив на флуоресценция. Разрешените във времето измервания на флуоресценция показват, че индуцираните от Ca 2+ ефекти се дължат на промени в околната среда на всички излъчващи триптофанови остатъци (четири в говежди α-LA и три в човешки α-LA, фиг. 1) [21]. Изразените флуоресцентни промени могат да се използват като точни монитори на константата на асоциация Ca 2+, която е много голяма и обикновено не може да бъде оценена от директни титрувания на Ca 2+, но може да бъде по-точно изчислена от титрувания на Ca 2+ натоварен α LA със силен Ca 2+ хелатор [3] .

5 Равновесни и кинетични метални йони, свързващи константи

Освен калция, α-LA свързва и други физиологично значими катиони като Mg 2+, Mn 2+, Na + и K +, които могат да се конкурират с Ca 2+ за същото място на свързване [19, 22]. Те предизвикват подобни, макар и по-малки, структурни промени в α-LA. Таблица 1 изброява сравнителни константи на свързване за тези катиони [19, 23]. Изглежда, че всички тези катиони се свързват с мястото на свързване на калция.

Катион Константи на асоцииране (M -1)
37 ° С 20 ° С
Са 2+ 2 × 10 7 3 × 10 8
Mn 2+ 3 × 10 8
Mg 2+ 211 ± 20; 46 ± 10 2000 ± 100; 200 ± 20
Na + 36 ± 10 100 ± 10
К + 6 ± 3 8 ± 3

В таблица 1 отбелязваме, че за магнезия са изброени две константи на свързване, тъй като изглежда, че α-LA притежава вторични места на свързване за този катион. Стойностите на константите на свързване за йони Mg 2+, Na + и K + са доста ниски, но като се вземат предвид високите им концентрации в клетката, може да се предположи, че те могат успешно да се конкурират с Ca 2+ йони in vivo.

Синтетичният пептид, съответстващ на остатъците 72–100 от естествения α-LA, съдържа Ca 2+ свързваща верига с фланкираща спирала, съдържаща остатъци 86–98 от α-домейн и 310 спирали от β-домейн. Ако Cys-73, Cys-77 и Cys-91 бъдат заменени с аланини, той свързва Ca 2+ много слабо (10 2 M -1) [24]. От друга страна, образуването на естествената дисулфидна връзка между Cys-73 и Cys-91 не увеличава афинитета му към Ca 2+ във вода, но го увеличава в 50% трифлуоретанол.

Според измерванията на спрян флуоресцентен поток, стойностите на константите на скоростта на дисоциация за комплекси от α-LA с Ca 2+ и Mg 2+ са практически еднакви и в рамките на 0,006 до 1 s -1 в температурния регион от 10 до 40 ° C [ 25]. Константите на скоростта на асоцииране за Ca 2+ и Mg 2+ в този температурен регион са съответно в рамките на 10 6 –10 7 и 10 1 –10 2 M −1 s -1. Интересно е, че константата на скоростта на асоцииране за комплекса Ca 2+ –α-LA е почти 1 до 2 порядъка по-ниска от границата, контролирана от дифузия, което е доста необичайно за протеините, свързващи калция. Една от възможните причини за това може да е съществуването на S-S мост, свързващ краищата на свързващия контур Ca 2+ в α-LA.

6 Протеинова стабилност

Катионното свързване със силния калциев участък повишава стабилността на α-LA. От данните за диференциална сканираща калориметрия (DSC), свързването на Ca 2+ измества термичния преход към по-високи температури с повече от 40 ° C [26, 27]. Свързването на Mg 2+, Na + и K + увеличава и протеиновата стабилност. Колкото по-силно се свързва йонът с протеина, толкова по-изразено е изместването на термичния преход.

Изненадващо свързването на Zn 2+ йони с натоварен с Ca 2+ α-LA намалява термичната стабилност, причинява агрегация и повишава неговата податливост на протеазно смилане [13, 28]. Термичният преход за натоварен с калций α-LA се случва при стайна температура при високи концентрации на цинк (моларно съотношение Zn: протеин около 100). Като цяло резултатите също така показаха, че α-LA е в частично разгънато и частично агрегирано състояние при наличие на високо [Zn 2+].

При липса на калциеви йони, но при наличие на физиологични концентрации на магнезиеви, натриеви и калиеви йони, термичният преход в α-LA се случва в района от около 30 до 45 ° C [29]. Това може да е свързано с известно регулиране на температурата на α-LA стабилността и функцията в млечната жлеза.

Свързването на метални катиони също повишава стабилността на α-LA срещу действието на денатуриращи агенти като урея или гуанидин хидрохлорид [19]. Тук важни характеристики на кривите на денатурация са различни, междинни стопени състояния, подобни на глобули, възникващи при междинни концентрации на денатуриране.

Забележително е, че свързването на калций стабилизира α-LA срещу налягане, както се наблюдава чрез повишаване на налягането с 200 Mpa, където се случва денатурация [30]. Интересното е, че свързването на калций увеличава стабилността на налягане на свързващата верига с калций до по-висока степен от стабилността на налягане на цялостната вторична структура на α-LA.

Много е важно да се отбележи, че всеки денатурационен преход в α-LA (температура, налягане, концентрация на денатурант) зависи от концентрацията на метални йони (особено тази на калциевите йони). По този начин стойности като температура на денатурация или денатурираща концентрация на урея или гуанидин хидрохлорид са относително безсмислени за α-LA, без да се посочва съдържанието (ите) на металните йони и тяхната концентрация (и).

Kuwajima и сътр. [31, 32] изучава кинетиката на повторно нагъване на апо-α-LA чрез експерименти със скок на pH със спиран поток. Кинетиката на безплатно прегъване на протеина има прост единичен експоненциален характер. Показано е, че Chaperone GroEL забавя повторното сгъване на апо-α-LA чрез взаимодействие със състоянието на разтопените глобули на протеина. Константата на свързване между GroEL и ранно сгъваемо междинно съединение на α-LA е от порядъка на 10 6 M -1 .

Накрая, повторното сгъване на говежди α-LA от неговото 6 M GuHCl денатурирано състояние [33] показва, че сгъването на протеина с четирите му дисулфидни връзки непокътнати съответства на един от ограничаващите случаи на сгъване на протеини, при който бързото колапсиране става на глобула с естествен сгъването е последвано от търсене на подобни на странична верига подобни на естествени контакти, които позволяват ефективно преобразуване в тясно опакованата естествена структура.

7 Ефекти на N-крайните мутанти върху белтъчните свойства

Тъй като започнахме проучвания на различни мутантни форми на α-LA, веднага стана ясно, че дивият тип рекомбинантен говежди α-LA, който се различава от млечно изолирания естествен протеин чрез добавяне на N-краен Met, има по-достъпни триптофанови остатъци, по-ниска термостабилност и намален афинитет на калций в сравнение с естествения протеин [34]. Ензимното отстраняване на N-крайния Met възстановява естествените свойства на α-LA. Взети заедно, флуоресценцията, кръговият дихроизъм и резултатите от DSC показват, че рекомбинантният див тип α-LA при липса на калциев йон е в състояние, подобно на разтопена глобула. Мутантът delta-E1 (или E1M), където остатъкът от Glu-1 от нативната последователност е генетично заместен, оставяйки N-краен метионин на негово място след бактериална експресия, показва почти един порядък по-висок афинитет към калция и по-висока термостабилност (както в отсъствието, така и в присъствието на калций), отколкото изолираният от мляко естествен протеин.

Ефектът от единичната мутация в N-края на α-LA е много интересен по много причини. Зареденият Glu-1 в говежди α-LA се намира на протеиновата повърхност и не дава явен принос за формирането на третичната структура (например солни мостове, водородни връзки с някои протеинови групи). В същото време, като е заредена група, тя допринася за баланса на електростатичните взаимодействия в протеина. Освен това, като хидрофилен остатък, той силно взаимодейства с водата и затова вероятно има тенденция да разгръща протеиновата структура. Добавянето на Met към N-крайния край прави ситуацията още по-лоша и причинява преминаването му към разтопена глобула-подобна конформация. Отстраняването на Glu-1 премахва такава тенденция, поради което вероятно мутантният протеин става по-стабилен. Може би остатъкът от Glu-1 в говежди α-LA се намира в някакъв критичен регион, което позволява превключване на протеиновата структура от силно твърда към стопена глобула.

8 Киселинен преход

9 Разтопено кълбо състояние

10 Свързване на нискомолекулни органични съединения и пептиди

α-LA взаимодейства с различни органични съединения с ниско молекулно тегло и тези взаимодействия се модулират чрез катионно свързване. Например, α-LA свързва UDP-галактоза, субстрата на лактозната синтазна реакция, както и UDP и UTP [13, 29]. Параметрите на свързване зависят от състоянието на протеина, но най-силната константа на свързване за UDP-галактоза е в диапазона от 10 3 до 10 4 M -1 .

α-LA свързва мелитин, къс пептид от пчелна отрова [42], който често се използва като модел целеви протеин за калмодулин. За разлика от другите протеини, свързващи калция, като калмодулин или тропонин С, α-LA свързва мелитин само в отсъствие на калциеви йони. Apo-α-LA се свързва с мелитин с константата на свързване 5 × 10 7 M -1. Свързването променя конформацията на мелитин от произволна намотка в разтвор до спираловидна структура в бинарния комплекс с апо-α-LA.

α-LA притежава няколко класа места за свързване на мастни киселини. Той свързва 5-доксилстеаринова киселина (DSA, аналог на мастна киселина, маркиран със спин, C22H42NO4), стеаринова киселина и палмитинова киселина. Параметрите на свързване зависят от белтъчното състояние. Явните константи на свързване за DSA са в диапазона от 10 4 до 10 6 M -1 [43] .

11 Взаимодействия с мембранни системи

α-LA взаимодейства и с липидните мембрани [44-49]. Хроматографията на Sephadex G-200 на смес от α-LA и DMPC, DPPC или лецитинови везикули разкрива, че значителна част от протеина се свързва с везикулите, където е възможно впоследствие да се изследват някои физични свойства на протеина в това състояние. Вътрешната флуоресценция на α-LA, свързана с везикули, е чувствителна към два термични прехода: Първият е гел-течният кристален преход на липидните везикули; втората възниква от денатурацията на протеина. Максималната позиция на флуоресценцията предполага, че при ниски температури достъпността на триптофана се увеличава при асоциирането на протеин-везикули. Изглежда, че триптофаните над протеиновия преход взаимодействат значително с аполарната фаза на везикулите. Експериментите за охлаждане също предполагат, че достъпността на триптофан се увеличава при асоциирането на протеин-везикули. Термичната денатурация на свързаната с липозома α-LA зависи от метално свързаното състояние на протеина [44, 45] .

При рН 2, където протеинът бързо се вмъква в бислоя, изолираният везикуларно-α-LA комплекс показва отчетлив флуоресцентен термичен преход, съответстващ на частично вмъкнат протеин, притежаващ някаква степен на третична структура, която се разгръща съвместно [44]. Това е в контраст с поведението на киселинното състояние α-LA в разтвор.

Тези резултати предполагат модел, при който се получава ограничено разширяване на конформацията при асоцииране на мембраната при неутрално рН, физиологична температура, с едновременно увеличаване на излагането на триптофан на разтворител и външни гасители. Данните могат да хвърлят светлина върху in vivo функцията и механизма на α-LA, тъй като той взаимодейства с галактозилтрансфераза върху мембранни повърхности в лумена на Голджи.

12 Функции на α-LA

Отдавна е известно, че α-LA е компонент на лактоза синтазата [1]: той комплексира с галактозил трансфераза само в присъствието на субстрати и модифицира нейната специфичност. Независимо от това, ролята на металните катиони във функцията на лактоза синтаза все още не е ясна. Един от субстратите, който се свързва с галактозилтрансфераза, UDP-галактоза, също се свързва с α-LA, но с доста нисък афинитет [13, 29]. Не е известно дали това свързване има някакво физиологично значение или не. Лактозната синтаза изисква Mn 2+ йони за оптимална функция и галактозил трансферазата и α-LA свързват Mn 2+ доста здраво.

Изненадващо, ролята на свързването на калция с α-LA в синтеза на лактоза все още е неясна. От друга страна, научихме, че свързването на Zn 2+ с α-LA може да модулира функцията на лактоза синтаза и това може да е физиологично значимо [48]. Свързването на цинк с α-LA променя както привидната константа на Michaelis К m (приложение) и V максимум лактоза синтаза. Тези ефекти зависят и от концентрацията на манган [48]: Zn 2+ предизвиква намаляване и на двете К m (приложение) и V max за Mn 2+, което води до видимо увеличение, последвано от намаляване на активността на лактоза синтаза при концентрации на Mn 2+ под насищане на първото място на свързване на Mn 2+ в GT. При високи концентрации на Mn 2+ Zn 2+ намалява активността на лактоза синтазата.

Pelligrini et al. [49] установи, че протеолитичното смилане на α-LA чрез трипсин и химотрипсин дава три пептида с бактерицидни свойства. Полипептидите са най-вече активни срещу Грам-положителни бактерии, което предполага възможна антимикробна функция на α-LA след частичното му усвояване от ендопептидази. Hakansson et al. [50] разкри вариант на сгъване α-LA с бактерицидна активност срещу устойчиви на антибиотици и чувствителни към антибиотици щамове на пневмокок. Активната форма на α-LA се пречиства от казеин чрез комбинация от анионообмен и гел хроматография. Интересно е, че нативният α-LA може да бъде превърнат в активна бактерицидна форма чрез йонообменна хроматография в присъствието на кофактор от казеин от човешко мляко, характеризиращ се като мастна киселина С18: 1. Както беше показано по-горе, α-LA притежава няколко класа места за свързване на мастни киселини [43] .

Kit et al. [52] показа, че олигонуклеотидите от човешкото мляко блокират както цитостатичните, така и цитотоксичните ефекти на α-LA. Те също така откриха, че както мономерните, така и мултимерните α-LA свързват олигонуклеотиди с различна дължина [53]. Те предполагат, че олигонуклеотидите се секретират от млечните клетки и че α-LA и ендогенните олигонуклеотиди могат да служат като фактори за регулиране на физиологичното състояние на клетките на млечните жлези. Освен това олигонуклеотидите могат да контролират цитотоксичния потенциал на млякото.