Отделение по биология на ветеринарните заболявания, Факултет по здравни и медицински науки, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

наддаване

Отдел за системна биология, Център за анализ на биологичната последователност, Технически университет в Дания, Лингби, Дания

Отделение по биология на ветеринарните заболявания, Факултет по здравни и медицински науки, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

Отделение за наука за животните към Университета в Орхус, Дания

Отделение по биология на ветеринарните заболявания, Факултет по здравни и медицински науки, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

Отделение по биология на ветеринарните заболявания, Факултет по здравни и медицински науки, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

Отделение по биология на ветеринарните заболявания, Факултет по здравни и медицински науки, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

Отделение по хранителни науки, Факултет по наука, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

Отделение за биология на ветеринарните заболявания, Факултет по здравеопазване и медицински науки, Университет в Копенхаген, Frederiksberg C, Дания

  • Брит Транберг,
  • Ларс И. Хелгрен,
  • Йенс Ликесфелдт,
  • Кристен Сейрсен,
  • Aymeric Jeamet,
  • Ида Рун,
  • Merete Ellekilde,
  • Денис С. Нилсен,
  • Аксел Корнеруп Хансен

Фигури

Резюме

Все повече изследвания показват, че млечните продукти, включително суроватъчен протеин, облекчават няколко нарушения на метаболитния синдром. Тук изследвахме ефектите на суроватъчния протеинов изолат (суроватка) при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, предполагайки, че метаболитните ефекти на суроватката ще бъдат свързани с промени в състава на чревната микробиота. Пет седмични мъжки мишки C57BL/6 са хранени с високо съдържание на мазнини диета ad libitum в продължение на 14 седмици, като източникът на протеин е или суроватка, или казеин. Фекалиите бяха събрани на седмица 0, 7 и 13 и фекалната микробиота беше анализирана чрез анализи на денатуриращ градиент гел електрофореза на ампликони, получени от PCR 16S rRNA ген (V3-регион). В края на проучването се събират и анализират плазмени проби за глюкоза, инсулин и липиди. Суроватката значително намалява наддаването на телесно тегло през първите четири седмици от проучването в сравнение с казеина (P Фигура 1. Телесно тегло през 14 седмици на диетична интервенция.

Телесното тегло на HF суроватка е било по-ниско от HF казеин през цялото време след седмица 0 (P Таблица 1. Прием на храна и ефективност на фуражите.

Докато натрупаният енергиен прием не се различава значително между HF суроватката и групата на HF казеин, ефективността на храненето е намалена в групата на HF суроватка в сравнение с HF казеин през първите четири седмици (P Таблица 2. Състав на тялото след 14 седмици диетична намеса.

Плазмени липиди

Общият холестерол на гладно в плазмата се понижава значително от суроватката (P Таблица 3. Плазмен липиден профил и гликемични параметри.

Гликемични параметри

Кръвната глюкоза на гладно преди приложението на глюкоза по време на OGTT е била значително по-ниска в групата на HF суроватка в сравнение с HF казеин (P Фигура 2. Тест за орален глюкозен толеранс след 12 седмици диетична намеса.

Клирънсът на глюкозата е значително подобрен чрез суроватка (P Фигура 3. Профил на фекална микробиота след 13 седмици диетична намеса.

В заключение суроватката значително облекчи няколко състояния, свързани с метаболитния синдром при мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини. Механизмите на ранния редуциращ ефект на суроватката върху телесното тегло, както и останалите метаболитни ефекти остават да бъдат проучени допълнително.

Материали и методи

Декларация за етика

Дизайнът на изследването е одобрен от Националния комитет за експерименти с животни, Министерство на правосъдието, Копенхаген, Дания (Номер на лиценза: 2007/561-1434 C1).

Експериментален дизайн

40 мъжки мишки C57BL/6NTac (Taconic, Laven, Дания) бяха закупени на възраст от три седмици и настанени в групи от пет със свободен достъп до храна и вода. Температурата се поддържаше на 20–24 ° C, относителната влажност беше 55% ± 10% и светлината автоматично се изключваше от 18:00 до 6:00. По време на две седмици на аклиматизация, всички мишки бяха хранени със стандартна диета за гризачи Altromin 1324 (Brogaarden, Дания). На възраст от пет седмици клетките бяха съпоставени с телесно тегло и разделени на три експериментални групи („HF казеин“, „HF суроватка“ и „LF казеин“), за да се хранят с високо съдържание на мазнини и казеин, високо -диета с изолат на суроватъчен протеин и диета с ниско съдържание на мазнини, съответно с казеин, както е описано по-долу. Групите бяха хранени със съответните тестови диети в продължение на 14 седмици. Теглото на тялото се записва седмично, а приема на храна се записва два пъти седмично.

Тестови диети

HF казеиновата група и LF казеиновата група се хранят с широко използваните казеинови D12492 и D12450B с 60%, съответно 10%, енергия от мазнини (Research Diets Inc., New Brunswick, NJ, USA). Групата с HF суроватка получава диета с високо съдържание на мазнини, подобна на HF казеин, с изключение на източника на протеин, който е заменен с изолат на суроватъчен протеин (направен по поръчка въз основа на D12492 от Research Diets) (Таблица 4). Изолатът на суроватъчен протеин се състои от неденатурирани разтворими суроватъчни протеини, обработени чрез йонообмен и ултрафилтрация (NZMP, Нова Зеландия). Аминокиселинните профили на двата протеинови източника са изброени в таблица S1.

Вземане на проби от фекалии и анализи

На 0, 7 и 13 седмици фекални пелети се събират в автоклавирани микроепруветки (Brand, Wertheim, Германия) веднага след дефекация. Ако мишката не се дефектира спонтанно при задържане, тя се държи в чиста клетка до дефекация. Първоначално пробите се държат на лед и впоследствие се съхраняват при -80 ° C до по-нататъшни анализи. ДНК екстракция, полимеразна верижна реакция (PCR), денатурираща градиентна гел електрофореза (DGGE) и анализи на данни бяха извършени, както е описано по-горе [39]. Накратко, бактериалната ДНК беше извлечена с помощта на QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Качеството и концентрацията на извлечената ДНК се проверяват на спектрофотометър NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, САЩ). След това генетичният материал се амплифицира чрез PCR, като се използват праймери, специфични за V3 областта на гена 16S rRNA и генетичният материал се отделя посредством DGGE върху полиакриламиден гел, съдържащ 30% -65% денатуриращ градиент (100% съответства на 7 M урея и 40% формамид). DGGE е обяснен допълнително на фигура S1.

Тест за орален глюкозен толеранс и HbA1c

Извършен е орален тест за толерантност към глюкоза (OGTT) след 12 седмици диетична интервенция. След едно нощно гладуване (10 часа) мишките се дават перорално с глюкозен разтвор от 2 mg глюкоза/g телесно тегло и глюкозата в кръвта се измерва преди дозиране и след 30, 60, 90, 120 и 180 минути с помощта на Freestyle Mini Glucometer (Hermedico, Копенхаген, Дания). На 13-та седмица HbA1c беше измерен на анализатор на Siemens DCA Vantage (Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Дания) чрез прехвърляне на 1 µl пълна кръв от пункция на вената на опашката в доставената касета за събиране.

Вземане на кръв и вземане на тъкани

След 14 седмици диетична интервенция, мишките бяха упоени със смес Hypnorm/Dormicum (Hypnorm: 0,315 mg/ml фентанил, 10 mg/ml флуанизон; VetaPharma Ltd, Лийдс, Великобритания. Dormicum: 5 mg/ml мидазолам; Roche A/S, Hvidovre, Дания), инжектиран подкожно като 1∶1∶2 стерилен воден разтвор (0,006 ml/g телесно тегло) след еднодневно гладуване (10 часа). Кръв се събира от периорбиталния плексус в покрити с EDTA микроепруветки (Milian, Женева, Швейцария) и веднага се центрофугира за плазма. Мишките бяха убити при изкълчване на шийката на матката. Чернодробните, мастните и мускулните тъкани бяха претеглени и държани на сух лед до съхранение при -80 ° C или фиксирани във формалин за бъдещи изследвания.

Плазмени анализи

Плазмената глюкоза, холестеролът, неестерифицираните мастни киселини и триацилглицеролите се анализират на автоматичен анализатор (Cobas Mira Plus, Roche Diagnostics, Hvidovre, Дания), като се използват реагенти от Horiba ABX (Montpellier Cedex 4, Франция). Плазменият инсулин се измерва с търговски комплект ELISA за мишки (Mercodia, Uppsala, Швеция). Индексът QUICKI е изчислен въз основа на логаритмичната трансформация: 1/(log инсулин [µU/ml] + log глюкоза [mg/dl]).

Статистика

Резултатите са представени като средно ± SEM, освен ако не е посочено друго. За управление и статистически анализ на данните бяха използвани софтуерният пакет Prism (версия 5.02, GraphPad Software Inc., Сан Диего, Калифорния, САЩ) и SAS Analyst (версия 9.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Експерименталните групи бяха сравнени чрез еднопосочен ANOVA и Post Hoc тест на Tukey. За OGTT бяха приложени както еднопосочни ANOVA върху площ под кривата (AUC), така и повторни измервания ANOVA с Post Hoc тест на Tukey. Когато е уместно, данните (глюкоза, инсулин) се трансформират в нормални стойности. Профилите на DGGE са анализирани за групиране чрез коефициент на сходство на зарове с толеранс на позицията на лентата и оптимизация от 1%, като се използва методът на нетеглена двойка с алгоритъм за аритметично осредняване на групиране (UPGMA) и анализ на главните компоненти (PCA) (BioNumerics, версия 4.5, Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Белгия), както е описано по-рано [39]. Нивото на значимост е определено на 0,05.