Резюме

Заден план

Известно е, че затлъстяването е свързано с възпаление, оксидативен стрес и последващо намаляване на целостта на ДНК на сперматозоидите. Важно е също така, че затлъстяването също е свързано с увеличаване на чревната пропускливост с преминаването на чревни бактерии в кръвообращението (метаболитна ендотоксемия), което предизвиква системно състояние на възпаление и произтичащ оксидативен стрес. Следователно, ние предположихме, че това свързано със затлъстяването повишаване на чревната пропускливост и произтичащата от това метаболитна ендотоксемия (ME) може да активира възпаление в репродуктивния тракт на мъжете, което води до повишено производство на реактивни кислородни видове, оксидативен стрес на сперматозоидите и намаляване на целостта на ДНК.

Резултати

Нашето пилотно проучване на 37 безплодни мъже потвърди значителна положителна корелация между индекса на телесна маса (ИТМ), повишена чревна пропускливост (серумен зонулин), метаболитна ендотоксемия (LBP), окислително увреждане на ДНК на сперматозоидите (семенни 8 OhDG) и увеличаване на нивата на фрагментация на ДНК на сперматозоиди (Халосперм). Метаболитната ендотоксемия е положително корелирана с нарастващите нива на окислително увреждане на ДНК на сперматозоидите, като тази връзка остава значителна, дори след корекция за съответните разграничители като възраст, ИТМ и дни на въздържание. Тези наблюдения предполагат, че метаболитната ендотоксемия и свързаният с нея оксидативен стрес могат да бъдат ключов двигател за увреждане на ДНК на сперматозоидите при мъже със затлъстяване.

Заключение

Това проучване потвърждава връзката между затлъстяването, увеличаването на чревната пропускливост и излагането на ендотоксини и оксидативно медиираното увреждане на ДНК на сперматозоидите. Това налага по-нататъшно проучване за пълно разбиране на ефекта от метаболитната ендотоксемия върху репродуктивната функция на мъжете, което може да доведе до новите терапии за подобряване на потенциала за плодовитост на мъжете.

Съжаляваме, изглежда нещо не работи правилно.

Моля, опитайте да опресните страницата. Ако това не помогне, моля, свържете се с екипа за поддръжка, за да можем да разрешим проблема.

Заден план

Безплодието е важен проблем за общественото здраве, засягащ 15% от двойките по света [1]. Мъжките фактори участват в 50% от случаите, като бащинското затлъстяване се предлага като основна причина както за намаляване на броя на сперматозоидите [2,3,4,5], така и за увеличаване на увреждането на ДНК на сперматозоидите [6], както и за епигенетични промени с възможни дългосрочни последици за здравето на детето, ако е настъпило зачеване [6]. Освен това, въпреки използването на асистирано репродуктивно лечение, затлъстяването на бащата е свързано в някои проучвания с намалена честота на раждаемост след лечение с ин витро оплождане (IVF), дори след контролиране на теглото на майката [7, 8]. Това може да е от особено значение, тъй като делът на мъжете с наднормено тегло или наднормено тегло в мъжете в репродуктивна възраст в развития свят вече надвишава 50% и изглежда се увеличава с времето [9].

Неотдавнашен преглед от Mushtaq et al. [10] съобщава, че мъжете със затлъстяване са по-склонни да намалят обема на спермата, общия брой на сперматозоидите и общия брой на сперматозоидите, което води до намалена плодовитост и плодовитост. Освен това, неотдавнашен метаанализ на 52 проучвания върху животни, изследващи въздействието на високомаслена обезогенна диета, също съобщава, че повишеното затлъстяване е свързано с намалено качество на спермата, намалено оплождане и спад в естествената плодовитост [11]. Kahn et al. [12] съобщават, че получените от мастна тъкан фактори, като адипокини и лептин, регулират съответно възпалението и производството на тестостерон. Повишеното системно възпаление води до увеличаване на активните видове кислород (ROS) и от своя страна фрагментация на ДНК на сперматозоидите. Освен това повишената температура на тестисите и бездействието също влошава сперматогенезата. Въпреки това общият ефект на затлъстяването върху нивата на хормоните, параметрите на спермата и целостта на ДНК на сперматозоидите е променлив, което предполага, че могат да се играят множество механизми [12].

Целта на това проучване е да се изследва ефектът от метаболитната ендотоксемия (LPS) върху производството и качеството на сперматозоидите. Предполагаме, че повишаването на нивата на ендотоксини ще активира възпалението в репродуктивния тракт на мъжете, което ще доведе до повишена активност на левкоцитите и оксидативен стрес на сперматозоидите с последващ спад в качеството на ДНК на сперматозоидите.

Методи

Кохорта за изучаване

Между февруари 2017 г. и юни 2017 г. 45 мъже на възраст от 18 до 50 години бяха наети от частна клиника за плодовитост в Южна Австралия (Repromed) чрез реклами. Критериите за включване са в безплодна връзка, а критериите за изключване са документирани възпалително или инфекциозно заболяване, първичен хипогонадизъм (синдром на Klinefelters, крипторхизъм или нараняване на тестисите), консумация на имуносупресивни лекарства (напр. Нестероидни противовъзпалителни лекарства (НСПВС), кортикостероиди или риба масло), добавки, които могат да променят чревната функция (напр. пробиотици, антибиотици през последния 1 месец) или някаква мъжка хормонална терапия (т.е. инхибитори на ароматазата, кломифен цитрат, човешки хорион гонадотропин (hCG) или тестостерон). Всички мъже са изследвани за субклинична инфекция на гениталните пътища с помощта на семенна плазмена еластаза [33]. Това проучване е одобрено от Комитета по етика на Университета на Южна Австралия (номер на одобрение 0000036399), като е получено информирано писмено съгласие от всички участници.

Протокол за изследване

Непробени проби от кръв и сперма бяха предоставени от всички участници между 7:30 ч. И 11:00 ч. В деня на тестването. Участниците също трябваше да представят проба от сперма чрез мастурбация след поддържане на абстиненционен период от 2–7 дни. Спермата се анализира в рамките на 2 часа след събирането. Събрани са и антропометрични мерки; височината беше измерена с точност до 1 см (Seca, 216, Германия). Теглото и процентът на телесните мазнини се измерват с помощта на скала за биоелектричен импеданс (Tanita, UM051, Tanita Corporation of America Inc.). Обиколката на талията се измерва от средната точка на разстоянието между върха на илиачния гребен и дванадесетото ребро и се измерва с точност до 1 cm. Индексът на телесна маса (ИТМ) се изчислява, като се използва уравнението телесно тегло (kg)/височина (m 2) и се класифицира, като се използват диапазоните на СЗО; поднормено тегло (2), нормално тегло (18,50 кг/м 2 - 24,99 кг/м 2), наднормено тегло (25,00 кг/м 2 - 29,99 кг/м 2) и затлъстяване (> 30 кг/м 2) [34].

Ендотоксинов анализ

Метаболитната ендотоксемия е количествено определена индиректно чрез анализ на липополизакарид свързващ протеин (LBP) на плазма в два екземпляра, използвайки разреждане 1: 1000, съгласно указанията на производителя (Hycult, Uden, Холандия), и както по-рано беше съобщено от нашата група [15, 16]. Минималната откриваема концентрация на LBP е 4,4 ng/mL. Протоколът за анализ не съобщава за кръстосана реактивност с нечовешки LBP.

Чревна пропускливост: Zonulin

Чревната пропускливост беше изследвана чрез измерване на нива на зонулин в плазмата в два екземпляра, като се използва човешки зонулин ELISA комплект съгласно инструкциите на производителя (Crux, Melbourne; Cusabio, USA). Този анализ отчита междувариационен коефициент на вариация от 3% и референтен диапазон от 0,156 ng/mL - 40 ng/mL.

Маркери за възпалителна активност на семенната плазма

Еластазата, маркер за неутрофилна активност в мъжкия репродуктивен тракт, се измерва в замразена (-80 ° С) и след това се размразява семенна плазма в два екземпляра, като се използва човешкият еластазен неутрофилен ELISA комплект в съответствие с инструкциите на производителя (Crux, Melbourne). Този тест имаше коефициент на вариация от 2% с референтен диапазон от 1,56 ng/mL - 400 ng/mL, с нива над 290 ng/ml, предполагащи инфекция/възпаление на пикочно-половите пътища [13].

Семенален оксидативен стрес: 8-хидрокси-2′-дезоксигуанозин (8-OHdG)

Възпалителният маркер 8-хидрокси-2′-дезоксигуанозин (8OHdG) също се измерва в замразени (-80 ° С) и след това се размразява семенна плазма в два екземпляра, използвайки човешки комплект 8OHdG ELISA, съгласно инструкциите на производителя (Crux, Мелбърн). Този анализ имаше референтен диапазон от 2,0 - 800 ng/mL.

Анализ на сперма

Общата концентрация на сперматозоиди е изчислена съгласно V насоките на СЗО [35]. ДНК фрагментацията също беше оценена в два екземпляра от същия анализатор съгласно указанията на производителя (Halosperm G2, Halotech, Испания). Накратко, общата подвижност на сперматозоидите беше изчислена след втечняване. Двеста сперматозоиди бяха преброени и определени като подвижни или неподвижни в зависимост от движението, класифицирано от СЗО [35]. Записани са числата и е определена процентна обща подвижност. Подготвен бе морфологичен слайд, фиксиран, оцветен и отбелязан, за да се определи морфологията на сперматозоидите в съответствие със строгите спецификации на СЗО, с докладван процент на добри морфологични сперматозоиди в 400 сперматозоиди [35]. Процентът на фрагментирана ДНК се определя след оценка на 400 отделни сперматозоиди. В нашата лаборатория висококачествени проби от сперматозоиди (напр. Донори на сперма) обикновено имат нива на увреждане на ДНК от Halosperm по-малко от 5%, като резултатите от пациентите над 20% обикновено се считат за ненормални.

Анализ на хормона

Серумът е анализиран за тестостерон, естрадиол, фоликулостимулиращ хормон (FSH) и лутеинизиращ хормон (LH) с помощта на автоматизиран имуноанализ на хемилуминесценция (Cobas 6000 e 601, Roche Diagnostics, САЩ), като откриваемите граници за всеки хормон са 18.4–110.10 pmol/L, 0.087–52.0 nmol/L, 0.1-200mIU/mL и 0.2-100mIU/mL съответно.

Статистически анализ

Статистическите анализи бяха проведени с помощта на Статистически софтуер за продукти и услуги, версия 23 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Данните се изразяват като средна стойност (+ стандартно отклонение), когато се разпределят нормално, или като медиана (интерквартилен диапазон), когато не се разпределят нормално според теста на Шапиро-Уилк. Корелациите бяха оценени с помощта на метода на Пиърсън, с лог трансформация на ненормално разпределени данни преди статистическия анализ. Където е уместно, бяха направени корекции на възрастта, състоянието на тютюнопушенето и мерките за затлъстяване.

Резултати

Характеристики на участника

Докато 43 мъже бяха оценени за допустимост; 5 бяха изключени за прием на рибено масло и 1 за прием на антибиотици през последния месец. От останалите 37 мъже, които са на разположение за анализ, средната им възраст е 36,9 ± 5,2 години, а ИТМ е 30,2 ± 4,7 kg/m 2. Само 10,8% от кохортата са с нормален ИТМ, като останалата част е или с наднормено тегло (ИТМ 25–29,9, 45,9%) или със затлъстяване (ИТМ> 30, 43,2%) [34]. По време на набирането на мъжкия потенциал за плодовитост на по-голямата част от участниците е бил неизвестен. След пълна оценка причините за безплодието са субекти с чист мъжки фактор 14 (37,8%), субекти с чист женски фактор 10 (27%), комбинирани мъже и жени с фактор 6 (16,2%) и неизвестна причина 7 субекта (19%). Кохортните демографски данни са посочени в таблица 1.

ИТМ, чревна пропускливост и излагане на ендотоксини

Както се очакваше, имаше значителна положителна корелация между маркера на чревната пропускливост серумен зонулин и ИТМ (R = 0,331, стр = 0,045). Имаше и значителна положителна връзка между зонулин и ендотоксемичния маркер LBP (R = 0,374, стр = 0,025). Не се забелязват обаче значими връзки между серумен зонулин и маркери за възпаление на репродуктивния тракт на мъжете (еластаза), окислително увреждане на сперматозоидите (8 OHdG) или някакъв маркер за качество на спермата.

Ендотоксемията (LBP) корелира положително с ИТМ и% телесни мазнини (R = 0,375, стр = 0,024; R = 0,407, стр = 0,017 съответно), (фиг. 1). Няма значими връзки между LBP и общия брой на сперматозоидите (R = 0,266, стр = 0,148), морфология на сперматозоидите (R = 0,305, стр = - 0,102) или подвижност на спермата (R = 0,107, стр = 0.208), като тези взаимоотношения остават непроменени след контролиране на възрастта, процента телесни мазнини и броя дни на въздържание. Ключова констатация беше положителната връзка между фрагментацията на сперматозоиди от ДНК и метаболитната ендотоксемия (LBP; R = 0,460, стр = 0,021), като тази връзка се поддържа дори след корекция на възрастта и процента телесни мазнини (r = 0,462, стр = 0,023) (Фиг. 1). Тази положителна корелация се запазва и след по-нататъшна корекция за дни на въздържание, ключов фактор, определящ целостта на ДНК на спермата (R = 0,434, стр = 0,027) [36].

ендотоксемия

Връзката между ИТМ и двете, и увреждане на ДНК на сперматозоиди и семенни 8-хидрокси-2′-дезоксигуанозин (8OHdG). а Връзка между индекса на телесна маса (BMI) и увреждане на ДНК на сперматозоидите. б Връзка между индекса на телесна маса (BMI) и семенния 8-хидрокси-2′-дезоксигуанозин (8OHdG)

Маркери за качество на сперматозоидната ДНК

Фрагментацията на сперматозоидна ДНК също е положително свързана с всички мерки за затлъстяване (ИТМ; R = 0,468, стр = 0,010,% телесни мазнини; R = 0,512, стр = 0,006, обиколка на талията; R = 0,460, стр = 0,012) (Фиг. 1).

Както се очаква, семенният 8OHdG, маркер на семенния оксидативен стрес, е в значителна положителна корелация с ИТМ (R = 0,418, стр = 0,021). Наблюдава се и отрицателна връзка между подвижността на сперматозоидите и семенните 8OHdG (след корекция за броя на сперматозоидите) (R = -0,624, стр = 0,002). Обратно, наблюдавана е значителна положителна връзка между експозицията на ендотоксини (LBP) и семенните 8OHdG (R = 0,440, стр = 0,016), потвърждаваща връзка между ендотоксемия и оксидативен стрес (фиг. 2). Seminal 8OHdG също е силно корелиран с ИТМ (R = 0,418, стр = 0,021) (фиг. 2).

Ефектът на LBP както върху семенната фрагментация на ДНК, така и върху семенния 8-хидрокси-2′-дезоксигуанозин (8OHdG). а Връзка между индиректна мярка на ендотоксин (LBP) и фрагментация на семенна ДНК. б Връзка между индиректна мярка на ендотоксин (LBP) и семенни 8-хидрокси-2′-деоксигуанозин (8OHdG)

Хормони

Както се очакваше, серумният тестостерон беше обратно корелиран с ИТМ, процент на телесни мазнини и обиколка на талията, със силни размери на ефекта за всеки (R = -0,623, стр 0,05 за всички).

Дискусия

Нашият изследователски екип наскоро демонстрира, че експерименталното приложение на ниски дози ендотоксин (0,8 ng Ешерихия коли O113: H10/kg телесно тегло) води до бърз спад в производството на тестостерон при здрави мъже в репродуктивна възраст [16], като по този начин директно потвърждава способността на бактериалния ендотоксин да нарушава функцията на тестисите. Резултатите от това пилотно проучване обаче са първите, които идентифицират значителна положителна връзка между експозицията на бактериален ендотоксин (LBP) и нарушената целостта на ДНК на сперматозоидите, като тази връзка остава значима дори след корекция за съответните фактори като възраст, ИТМ и продължителност на въздържанието . Резултатите от нашето проучване дават известна представа за потенциалния механизъм за повишените нива на увреждане на ДНК на сперматозоидите, наблюдавано при затлъстели мъже. В обобщение ние вярваме, че затлъстяването и свързаната с него лоша диета причиняват увеличаване на чревната пропускливост, което позволява на бактериите да се трансмигрират от чревния лумен в циркулацията (метаболитна ендотоксемия), което води до активиране на възпалителен отговор. Този ендотоксин предизвиква възпаление, прелива в мъжкия репродуктивен тракт, където увеличава производството на левкоцити на ROS, което води до окислителна атака на ДНК на сперматозоидите и намаляване на целостта на ДНК на сперматозоидите.

Зонулин, протеин, динамично произведен от чревния епител и черния дроб, който обратимо регулира чревната пропускливост чрез модулиране на междуклетъчни стегнати връзки и обикновено се счита за полезен неинвазивен сурогатен маркер на чревната пропускливост. В състояние на затлъстяване се наблюдава увеличаване на базалното производство на зонулин и произтичащо намаляване на експресията на два епителни протеина с плътно свързване; запушване и zonula occludens-1 [37], което след това позволява на бактериите да се транслоцират между чревния лумен и кръвообращението [38], предизвиквайки имунната система до [13, 22, 23].

Pilatz et al. [46] показа, че системното възпаление, свързано със затлъстяването (повишаване на CRP и IL-6), не се превръща в повишаване на семенните плазмени цитокини или повишаване на семенната плазмена еластаза, резултат също в съгласие със собствените ни открития. Това предполага, че системното възпаление, свързано със затлъстяването, може да не достигне мъжкия репродуктивен тракт или че LPS инициира локализирано възпаление в епидидима и тестисите, може да не доведе до откриваеми промени в семенните плазмени цитокини или еластаза, но все пак да медиира увреждане на сперматозоидите чрез иницииране на локализиран оксидативен стрес.

Нашите резултати показват, че в контекста на свързаното със затлъстяването оксидативно увреждане на ДНК, потенциален алтернативен подход на традиционния антиоксидантен подход може да бъде прилагането на терапии, които подсилват чревната бариерна функция, намалявайки последващата метаболитна ендотоксемия и възпаление и свързаните с тях оксидативни увреждания на сперматозоидите. Един потенциален подход би бил използването на пробиотици, за които се съобщава, че подобряват чревната бариерна функция, намаляват метаболитната ендотоксемия и възпалението [47]. Няколко проучвания с животни [48] и едно скорошно изследване на хора [49] съобщават, че пробиотиците наистина могат да повишат качеството на сперматозоидите и нивата на тестостерон. Ние предположихме, че този благоприятен ефект се медиира от намаляване на метаболитната ендотоксемия [50].

Заключения

Резултатите от това проучване предполагат за първи път връзка между затлъстяването, индуцирано от МЕ, повишаване на чревната пропускливост и нивата на ендотоксини, и оксидативно медиирано увреждане на ДНК на сперматозоидите. Въпреки че не успяхме да открием пряка връзка между чревната пропускливост (плазмен зонулин) и всеки маркер за качество на сперматозоидите, ние вярваме, че това отразява факта, че зонулинът отразява само промени в парацелуларната чревна пропускливост, а не транс-клетъчното преминаване на чревния ендотоксин медиирани от мицели на мазнини и жлъчка. Тези резултати са важни, тъй като предполагат, че новите терапии, насочени към повишаване на чревната бариерна функция, могат да намалят свързаното със затлъстяването възпаление, оксидативен стрес, като по този начин повишат качеството на сперматозоидите.