Мин-Сиан Ян

* Катедра по гастроентерология, болница Шандонг Цянфошан, Медицинско училище в Шандонг, Шандонг, Китай.

Хонг-Бо Рен

† Катедра по гастроентерология, болница Qilu на университета в Шандонг, Шандонг, Китай.

Yi Kou

‡ Отделение по гастроентерология, болница Liangxiang в Пекин, Пекин, Китай.

Мин Менг

§ Катедра по гастроентерология, болница Anyang, Хенан, Китай.

Ян-Цин Ли

† Катедра по гастроентерология, болница Qilu на университета в Шандонг, Шандонг, Китай.

Резюме

Предистория/Цели

Диетите с високо съдържание на мазнини допринасят за фиброгенезата на панкреаса, но патогенезата остава неясна. Това проучване изследва ролята на ядрения фактор каппа В (NF-кВ) в панкреатичната фиброза, предизвикана от диета с високо съдържание на мазнини при плъхове.

Методи

Мъжките плъхове Wistar са били хранени с високомаслена диета или стандартна нормална чау в продължение на 20 седмици. Панкреатичната фиброза се определя чрез червено оцветяване на Sirius. Имунохистохимично оцветяване, верижна реакция с обратна транскрипция-полимераза и Western blotting бяха използвани за идентифициране на NF-κB-свързани гени или протеинови експресии.

Резултати

Възпаление, отлагане на мазнини, активиране на звездни клетки на панкреаса и фиброза са наблюдавани в панкреасите от групата с високо съдържание на мазнини. Експресията на NF-κB субединица p65 (NF-κB/p65) е локализирана в ядрото и междуклетъчната адхезионна молекула 1 (ICAM-1) е свръхекспресирана. Нивата на експресия на гена на панкреаса на NF-κB/p65, ICAM-1 и фактор на туморна некроза α са били повишени значително при плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, в сравнение с контролните плъхове. Уестърн блотингът също така разкрива значително повишени нива на ICAM-1 и ядрен NF-κB/p65 при плъхове, хранени с диети с високо съдържание на мазнини, в сравнение с контролни плъхове.

Заключения

NF-κB участва в панкреатична фиброза, свързана с диета с високо съдържание на мазнини.

ВЪВЕДЕНИЕ

Продължителният прием на диети с високо съдържание на мазнини се счита за вреден за панкреаса. Според предишни проучвания диетите с високо съдържание на мазнини могат да предизвикат панкреатични ендокринни и екзокринни аномалии, 1 - 3 повишени възпалителни цитокини в тъканите на панкреаса, 4, 5 и активиране и фиброгенеза на панкреатични звездни клетки (PSC). 6, 7

Диетите с високо съдържание на мазнини подбуждат оксидативен стрес в панкреаса, 6, 7, за който е доказано, че участва в активирането на PSCs и фиброзата на панкреаса. 8, 9 Въпреки че в панкреаса в животински модел са били открити повишени нива на тромбоцитен растежен фактор тип бета и трансформиращ растежен фактор бета 1 (TGF-β1) след хранене с високо съдържание на мазнини, 7 обаче, регулаторните механизми и сигнализиране пътищата, участващи в този процес на увреждане на оксидите, не са изяснени и знанията ни остават ограничени.

Ядреният фактор kappa B (NF-κB) е оксидативен стрес-чувствителен транскрипционен фактор, който модулира голямо разнообразие от гени, включително провъзпалителни цитокини и адхезионни молекули като тумор некротизиращ фактор α (TNF-α) и междуклетъчна адхезионна молекула 1 ( ICAM-1). 10 - 12 спокойни PSC могат да бъдат стимулирани от цитокини, растежни фактори и реактивни кислородни видове (ROS) 9, 13, за да синтезират и отделят увеличени количества извънклетъчен матрикс. Активираните PSC промотират автокринни фактори, включително ICAM-1, TNF-α и TGF-β от своя страна. 9, 14, 15

С оглед на горните съображения, ние предполагаме, че NF-κB може да участва във вредните ефекти върху панкреаса, които се дължат на хронични диети с високо съдържание на мазнини. В настоящото проучване ние хранехме плъхове с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 20 седмици, наблюдавахме хистологични промени, изследвахме експресия на някои молекули, свързани със сигналните пътища на NF-κB в панкреаса, и обсъждахме основните последици от нашите резултати.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

1. Животни модели

Това проучване получи одобрението на Комитета по етика на университета Шандонг. В експеримента са използвани двадесет и четири мъжки плъхове Wistar (с тегло от 167 до 188 g, получени от лабораторния център за животни на университета Шандонг). Те се поддържат в съответствие с Наредбите за лабораторни грижи и употреба на животните от университета в Шандонг. Плъховете получават редовно чау-чау в продължение на 1 седмица, за да се аклиматизират в новата си среда и след това са разделени на две диетични групи, базирани на съпоставимо телесно тегло. Плъховете в контролната група (n = 10) получават редовно чау; плъховете в третираната група (n = 12) са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини (2% холестерол, 10% свинска мас и 88% редовно чау, както за контролната група). Всички плъхове са хранени в продължение на 20 седмици от началото на експеримента. Животните се умъртвяват след гладуване през нощта и се анестезират чрез интраперитонеална инжекция с пентобарбитал натрий (50 mg на kg телесно тегло), като по това време се получават тъкани на панкреаса.

2. Хематоксилин и еозин (H&E) и червено оцветяване на Sirius

Пробите от панкреаса бяха фиксирани с формалин, вградени в парафин и нарязани на участъци с дебелина 5 µm и оцветени с H&E за хистологични наблюдения. Резултатът от възпалението и отлагането на мазнини се оценява, както следва: 0, 0%; 1, 0% до 25%; 2, 25% до 50%; 3,> 50%.

За откриване на колаген, срезовете бяха депарафинирани и потопени за 25 минути в наситена водна пикринова киселина, съдържаща 0,5% Sirius червено, за да оцветят колагеновите влакна, и изложени на харис хематоксилин за 3 минути, за да оцветят ядрата. При тези условия колагеновите фибрили изглеждат червени, а нефиброзните области изглеждат сини. Фиброзната площ беше измерена чрез софтуер за анализ на ImageJ версия 1.39n (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) (http://rsb.info.nih.gov/ij/) и беше изразена като фибротичен индекс (фиброзен индекс = площ на панкреатична фиброза/обща площ на пробата × 100%).

За оценка на хистологичните промени от всеки плъх бяха избрани произволно три участъка на панкреаса и във всеки участък бяха заснети пет неприпокриващи се полета за наблюдение.

3. Имунохистохимично оцветяване

Секции на панкреаса се инкубират с първични миши анти-плъхови IgG антитела (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) при 4 ℃ за една нощ и след това се инкубират с биотинилирани кози анти-миши вторични антитела и HRP-конюгиран стрептавидин (Santa Cruz Biotechnology ) при стайна температура за 15 минути. Като разтвор за изплакване се използва дестилирана вода с 0,4% твин 20 фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS) (v/v). Отрицателни контроли бяха направени при липса на първични антитела. Когато се оцветява за NF-kB/p65, първичното антитяло се разрежда с 0,3% тритон в PBS (v/v) и двете клетки, оцветени в цитоплазма и ядро, се считат за положителни. За наблюдение от всеки плъх бяха избрани произволно три секции на панкреаса и във всеки раздел бяха уловени пет непокриващи се полета за по-нататъшен анализ. Отчита се средният брой на NF-kB/p65 или ICAM-1 положителни оцветени клетки (кафяви) на поле с висока мощност. Площите, оцветяващи положително за α гладкомускулен актин (α-SMA), бяха измерени чрез софтуера ImageJ и изразени като процент от общата площ.

4. Генна експресия

Експресията на гена се определя чрез верижна реакция с обратна транскрипция-полимераза (RT-PCR). PCR се извършва с реакционни смеси, съдържащи dNTP, сензорни и антисенс праймери и TaqDNA полимераза (Takara, Shiga, Япония). β-актинът се използва като вътрешен стандартен контрол. PCR праймерите и условията са както следва: NF-κB/p65: смислов праймер: 5'-ATGGACGATCTGTTTCCC-3 ', антисенс праймер: 5'-GTCTTAGTGGTATCTGTGCT-3', размер на фрагмента: 170 bp, PCR състояние: 94 ℃, 45 "; 60 ℃, 45 "; 72 ℃, 45 ", 35 цикъла; ICAM-1: смислов праймер: 5'-AGCCTCAGGCCTAAGAGGAC-3 ', антисенс праймер: 5'-AGGGGTCCCAGAGAGGTCTA-3', размер на фрагмента: 496, PCR състояние: 94 ℃, 45"; 58 ℃, 45 "; 72 ℃, 45", 35 цикъла; TNF-α: смислов грунд: 5'-TCGTAGCAAACCACCAAG-3 ', антисмислен грунд: 5'-CTGACGGTGTGGGTGA-3', размер на фрагмента: 193 bp, PCR състояние: 94 ℃, 45 "; 50 ℃, 45"; 72 ℃, 45 ", 35 цикъла; β-актин: смислов праймер: 5'-AAGATCCTGACCGAGCGTGG-3 ', антисенс праймер: 5'-CAGCACTGTGTTGGCATAGAGG-3' размер на фрагмента: 327 bp, PCR състояние: 94 ℃, 45"; 58 ℃, 45 "; 72 ℃, 45", 35 цикъла.

PCR продуктите се разделят чрез гел електрофореза (1,5% агароза, оцветена с етидиев бромид). Конкретни ленти бяха визуализирани със система за изображения (FluorChem 9900; Alpha Innotech, Сан Леандро, Калифорния, САЩ). Интензивността на лентите се анализира с помощта на софтуера ImageJ и се стандартизира за β-актинов сигнал.

5. Уестърн блотинг

Панкреатичните тъкани се нарязват на малки парченца, измиват се с PBS (рН 7,4) и след това се хомогенизират в ледено студен лизисен буфер (10 mM Hepes, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM дитиотреитол (DTT), 1,5 mM фенилметилсулфонил флуорид (PMSF), 20 тМ NaF, 200 цМ Na3VO4 и протеазен инхибиторен коктейл). След като пробата се държи на лед в продължение на 20 минути, NP-40 се добавя до крайна концентрация от 0,5% и след това пробите се инкубират върху лед за още 20 минути и се центрофугират при 10 000 х g за 2 минути при 4 ° С. Супернатантите се използват като цитозолни екстракти за измерване на ICAM-1. Пелетите се промиват с PBS и се суспендират отново в буфер за ядрена екстракция (20 mM Hepes, 420 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1,5 mM PMSF, 20 mM NaF, 200 цМ Na3VO4 и инхибитор на протеазата коктейл) за 20 минути върху лед и центрофугиране при 15 000 × g за 15 минути при 4 ℃. Супернатантите, съдържащи ядрен протеин, се събират за откриване на NF-kB/p65.

Равно количество протеин (20 ug) се зарежда в различни платна и се разделя с 12% натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза. Основните антитела (Santa Cruz Biotechnology) са NF-κB/p65 (1: 150) и ICAM-1 (1: 200). Използвано е конюгирано с пероксидаза вторично антитяло (1: 1 250; биотехнология Santa Cruz) и мембраната се визуализира чрез засилена хемилуминесценция. Интензивността на лентите беше количествено определена с помощта на софтуера ImageJ и стандартизирана към сигнала на контролата.

6. Статистически анализ

Всички стойности са представени като средни стойности ± SD. Значимостта на разликите между двете експериментални групи беше анализирана с независими проби t-тест, използвайки софтуер SPSS версия 15.0 (SPSS Inc., Чикаго, IL, САЩ). Стойностите на вероятността по-малки от 0,05 се считат за значими.

РЕЗУЛТАТИ

1. Телесно тегло и панкреатичен оксидативен стрес

Всички животни са натрупали телесно тегло през експерименталния период. Но телесното тегло на плъхове, хранени с диети с високо съдържание на мазнини, е 122,1% от това на контролните плъхове в края на експеримента. Нивото на малондиалдехид се повишава, докато активността на супероксиддисмутазата намалява значително в панкреаса на плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини, в сравнение с тези на контролните плъхове (данните не са показани), както съобщихме в предишното ни проучване. 6

2. H&E и Sirius червено оцветяване

H&E оцветени участъци от плъхове, хранени с високо съдържание на мазнини, разкрива отлагане на мазнини в частични ацинарни и островни клетки, както и клетъчна атрофия. Инфилтрация на лимфоцити също се наблюдава в тези проби. В допълнение, пробите на панкреаса на плъхове, хранени с диети с високо съдържание на мазнини, показват очевидно отлагане на червено оцветено колаген от Sirius, заобикалящо лобулите и в периацинарните области на панкреасния панкреим. За разлика от това, за проби, взети от контролни животни, не е представено или е установено само леко отлагане на колаген (Таблица 1 и Фиг. 1).

участие

маса 1

Хистологични промени в панкреатичната тъкан при плъхове на 20-та седмица

Данните са представени като средна стойност ± SD. Хистологичните промени бяха оценени, както е описано в Материали и методи.

* p Фиг. 2Aa, b и B). ICAM-1 се експресира главно в съдови ендотелни клетки и някои ацинарни клетки и неговата експресия е по-силна при плъхове, хранени с диети с високо съдържание на мазнини, отколкото при контролни плъхове (12,27 ± 1,75 срещу 21,07 ± 3,65, p Фиг. 2Ac, d и B) . В диетични проби от панкреас с високо съдържание на мазнини се наблюдават α-SMA-положителни зони на оцветяване, които се представят главно в периацинарното пространство (0,26 ± 0,07 срещу 4,85 ± 0,45, p Фиг. 2Ae, f и C).

Имунохистохимично оцветяване за ядрен фактор kappa B p65 (NF-κB/p65), молекула на междуклетъчна адхезия 1 (ICAM-1) и актин на гладката мускулатура (α-SMA) (× 400) и съответния статистически анализ. (A) Представителна имунохистохимия за NF-κB/p65 (a, b), ICAM-1 (c, d) и α-SMA (e, f) (контрол, a, c, e; високомаслено, b, d, е). За оцветяване с NF-kB/p65 клетките с оцветена цитоплазма и оцветено ядро ​​(кафяво) се считат за положителни. (B, C) Съответният статистически анализ. Отчита се средният брой на NF-kB/p65- или ICAM-1-положителни (кафяви) клетки на поле с висока мощност. Площите, оцветяващи положително за α-SMA, се изразяват като проценти от общата площ. Данните са представени като средни стойности ± SD. Контрол, n = 10; Богато на мазнини, n = 12.

Експресия на ген в проби на панкреаса. (A) Резултати от обратна транскрипция-полимеразна верижна реакция (RT-PCR) за ядрен фактор kappa B p65 (NF-κB/p65) (a), молекула на междуклетъчна адхезия 1 (ICAM-1) (b), тумор некрозис фактор α ( TNF-α) (c) и β-актин (d). Показват се представителни резултати от RT-PCR. (B) Относителната интензивност на лентите за производство на PCR беше анализирана с помощта на софтуера ImageJ (Национални здравни институти). Данните се изразяват като съотношение на всяка иРНК към съответната β-актинова иРНК. Данните са представени като средни стойности ± SD. Контрол, n = 10; Богато на мазнини, n = 12.

Експресия на протеин в проби на панкреаса. (A) Western blots, показващи експресията на вътрешноядрен протеинов ядрен фактор kappa B (NF-κB)/p65 и цитозолна протеинова молекула на междуклетъчна адхезия 1 (ICAM-1). Показва се представително изображение от три експеримента. (B) Относителната интензивност на Western blot лентите беше анализирана с помощта на софтуера ImageJ. Данните са изразени като проценти от контролните стойности. Данните са представени като средни стойности ± SD. Контрол, n = 10; Богато на мазнини, n = 12.

* p 2, 6, 16 и е установено, че фиброзата на панкреаса се подобрява чрез инхибиране на оксидативния стрес. 17, 18 Тези открития предполагат мощна роля за оксидативния стрес във фиброгенезата на панкреаса, свързана с диетата с високо съдържание на мазнини.

По този начин, NF-kB, ROS-чувствителен транскрипционен фактор, може да участва в основната молекулярна патогенеза на тази аномалия на панкреаса. Активираният NF-кВ регулира експресията на много молекули, включително цитокини и адхезионни молекули. TNF-α, провъзпалителен цитокин, може да повлияе на NF-κB пътя и да стимулира неговото активиране. 19 В настоящото ни проучване открихме PSC активиране и фиброгенеза в панкреатични тъкани на плъхове, хранени с диета с високо съдържание на мазнини, и също така установихме повишени нива на NF-κB/p65 иРНК и по-висока експресия на протеини в ядрения p65 в тези проби според RT-PCR, имунохистохимия и Western blot. Съществуват изобилие от доказателства, че свързаното с оксидативен стрес активиране на NF-кВ е свързано с възпаление и фиброза, 20, 21 и блокадата на активността на NF-кВ може да предотврати прогресирането на хроничния панкреатит чрез инхибиране на ECM синтеза и производството на възпалителни цитокини. 22 Следователно предполагаме, че NF-κB може да участва не само в възпаление на панкреаса, но и във фиброза при плъхове, хранени с диети с високо съдържание на мазнини.

От друга страна, ние също открихме, че както ICAM-1, така и TNF-α, молекулите надолу по веригата на NF-κB, са с повишено регулиране. Тези открития показват, че дългосрочната диета с високо съдържание на мазнини води до активиран NF-κB сигнален път в панкреаса. Повишеният TNF-α в панкреаса може да действа като положителна обратна връзка за реактивиране на NF-κB от своя страна и да насърчи по-нататъшното развитие на това заболяване.

Както знаем, TGF-β е профиброгенетичен фактор и основен медиатор на панкреатичната фиброза, който може да насърчи активирането на PSC и секрецията на ECM. 9 Неотдавнашни проучвания демонстрират кръстосана връзка между NF-κB и TGF-β сигналните пътища: 1) NF-κB може да предизвика TGF-β генна транскрипция; 2) потискането на NF-кВ намалява автокринността на PSC от TGF-β1; 24 3) свръхекспресираният Smad7 блокира активирането на NF-кВ и възпалителната експресия на цитокини и ICAM-1 и инхибира фиброзата. 25, 26 Тези резултати предполагат тясна връзка между активирането на NF-кВ и експресията на TGF-β. Съответно в нашето проучване, ние открихме свръхекспресиран NF-κB/p65 в тъканите на панкреаса, взети от плъхове, хранени с високомаслени диети. Това повишено регулиране на NF-кВ може да допринесе за експресията на TGF-β1.

Следователно, въз основа на резултатите от нашето изследване, предполагаме, че механизмът на свързаната с диетата панкреатична фиброза с високо съдържание на мазнини може да се дължи отчасти на активиране на NF-κB след свръхекспресия на противовъзпалителни цитокини, които могат да предизвикат взаимодействия на различни молекули и започват фиброгенезата на панкреаса.

Ние признаваме, че в нашето проучване има ограничения. Не е ясно дали хистологичните промени в панкреаса ще бъдат подобрени автоматично, ако диетата с високо съдържание на мазнини бъде спряна. Освен това има и други молекули, които участват в активирането на NF-кВ, като I-кВ киназа и други протеини. Други сигнални пътища, които са свързани с активирането на PSC, като MAPK и JAK/STAT пътища не са изследвани в нашето проучване. Но нашето проучване може да има значителни клинични последици. Изправени сме пред глобална епидемия от затлъстяване и вече има широко признание за връзките между затлъстяването и метаболитните нарушения. Трябва да се насърчават бъдещи клинични и експериментални проучвания за изследване на дълбоките съотношения между диета с високо съдържание на мазнини, затлъстяване и увреждане на панкреаса.

ПРИЗНАВАНИЯ

Авторите биха искали да благодарят на д-р Уилям Там от болница Royal Adelaide, Австралия за критичното четене на ръкописа. Тази работа беше подкрепена с безвъзмездни средства от Министерството на науката и технологиите и Министерството на общественото здраве на провинция Шандонг, Китай (№ 2009HZ069).