Кристин С. Макграт

* Факултет по природни науки, Факултет по медицински и молекулярни биологии, Технологичен университет-Сидни, Сидни, Ню Югоизточна Австралия

плътност

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

Сяо Хонг Ли

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

§ Отдел по ендокринология, Народна болница в Деджоу, Шандонг, Китай

Филипа Т. Уитуърт

* Факултет по природни науки, Факултет по медицински и молекулярни биологии, Технологичен университет-Сидни, Сидни, Ню Югоизточна Австралия

Робърт Каш

* Факултет по природни науки, Факултет по медицински и молекулярни биологии, Технологичен университет-Сидни, Сидни, Ню Югоизточна Австралия

Джоан Т. Тан

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

Сюзън В. Макленън

** Дисциплина на медицината, Университет в Сидни, Сидни, Ню Югоизточна Австралия

Дейвид С. Челермайер

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

** Дисциплина на медицината, Университет в Сидни, Сидни, Ню Югоизточна Австралия

†† Отделение по кардиология, болница Royal Prince Alfred, Camperdown, NSW, Австралия; и

Филип Дж. Бартър

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

§§ Медицински факултет, Университет на Нов Южен Уелс, Рандуик, Ню Юг, Австралия

Кери-Ан Рай

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

§§ Медицински факултет, Университет на Нов Южен Уелс, Рандуик, Ню Юг, Австралия

Алисън К. Хедър

* Факултет по природни науки, Факултет по медицински и молекулярни биологии, Технологичен университет-Сидни, Сидни, Ню Югоизточна Австралия

† Институт за изследвания на сърцето, Нютаун, NSW, Австралия

Свързани данни

Резюме

Чернодробното възпаление може да предизвика инсулинова резистентност чрез дисбаланс в секрецията на провъзпалителни цитокини, след активиране на възпалителни/окислителни транскрипционни фактори (1). Ключов транскрипционен фактор, който медиира възпалителния отговор в хепатоцитите, е ядрен фактор κB (NF-κB) (2, 3). Активираният чернодробен NF-кВ сам може да стимулира инсулинова резистентност, както се вижда от констатацията, че трансгенната експресия на инхибитор на ядрен фактор кВ киназна субединица β (IKK-β), която увеличава активността на NF-кВ, води до явна инсулинова резистентност при мишки, хранени с нормално чау диета (4). Обратно, когато хетерозиготни IKK-β +/− мишки, експресиращи ниски нива на NF-kB, се хранят с високомаслена диета (HFD) или се кръстосват с ob/ob мишки, те не развиват инсулинова резистентност (5). Освен това генетичната манипулация за инхибиране на чернодробната активност на NF-кВ директно предпазва от инсулинова резистентност в отговор на HFD при мишки (4). Такива открития предоставят сериозни доказателства, че черният дроб е основно място на възпалително действие, което причинява инсулинова резистентност, и че NF-κB е централен патогенен фактор в основата на индуцирана от възпаление инсулинова резистентност.

Активирането на NF-кВ увеличава секрецията на редица провъзпалителни цитокини, включително интерлевкин (IL) -6, TNFα и IL-1β (1). Активирането на NF-κB включва сложна поредица от сигнални събития, които започват с активиране на инхибитора κB (IκB) киназен комплекс, който от своя страна фосфорилира IκB (6, 7). IκB е инхибиторен протеин на NF-kB, който се свързва с NF-kB, като го секвестира в цитоплазмата (8). След като обаче се фосфорилира, IκB е насочен към убиквитинация и последващо разграждане, оставяйки NF-κB свободен да се транслоцира в ядрото и да инициира транскрипция на целеви гени (9).

Липопротеините с висока плътност (HDL) имат мощни противовъзпалителни ефекти (10, 11). По-рано съобщавахме, че предварителната обработка на човешки ендотелни клетки на коронарните артерии с HDL инхибира индуцираната от TNFα NF-κB активиране (12). В допълнение, инжекциите на човешки аполипопротеин A-I (apoAI) (основният HDL протеин) в зайци инхибира съдовото възпаление (10). Съобщава се, че нивата на HDL са ниски при субекти с инсулинова резистентност (13), така че това ни накара да се запитаме дали повишаването на HDL може да подобри инсулиновата резистентност чрез насочване към повишеното чернодробно възпалително състояние. Ние показваме, че инжекциите на безлипиден apoAI намаляват както чернодробните, така и системните нива на цитокини, потискат чернодробното активиране на NF-κB и подобряват чувствителността към инсулин при мишки C57BL/6 с високо съдържание на мазнини. Освен това, ние демонстрираме, че съдържащите apoAI възстановени HDLs (rHDLs) медиират техните противовъзпалителни ефекти в култивирани хепатоцити чрез потискане на IκB киназата (IKK)/IκB/NF-κB сигнальния път.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Приготвяне на apoAI без липиди и дискоидални rHDLs

HDL се изолират от обединената човешка плазма (Gribbles Pathology, Adelaide, SA, Австралия) чрез последователно ултрацентрифугиране в диапазона на плътността 1.063–1.21 g/ml. След това апоАИ без липиди се изолира от HDL, както е описано по-рано (14). Дискоидалните rHDLs, съдържащи apoAI, комплексирани към 1-палмитоил-2-линолеоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолин (PLPC) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), са приготвени по метода на холатната диализа (15). Моларното съотношение PLPC: apoAI е 100: 1. Непосредствено преди употреба в експерименти, безлипидни апоАИ или rHDL препарати се диализират екстензивно срещу фосфатно-буфериран физиологичен разтвор (PBS) без ендотоксин (рН 7.4) (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Австралия).

Животински модел

Тестове за глюкозна толерантност, инсулинова толерантност и тестове за предизвикване на пируват; измерване на серумните триглицериди, цитокини и инсулин на гладно

В края на проучването при мишки на гладно през нощта бяха проведени интраперитонеален тест за глюкозен толеранс (IPGTT), интраперитонеален тест за инсулинов толеранс (IPITT) и тест за предизвикване на пируват. Кръвни проби бяха получени от върха на опашката в посочените часове и нивата на глюкоза бяха измерени с помощта на глюкомер (Accu-Chek, Roche Diagnostics, Castle Hill, NSW, Австралия). Дозите, използвани по време на тези тестове, са глюкоза при 1 g/kg телесно тегло, инсулин при 0,75 IU/kg телесно тегло и пируват при 2 g/kg телесно тегло, съответно за IPGTT, IPITT и пируват. Нивата на серумни триглицериди са измерени с триглицериден реагент (Roche Diagnostics). Нивата на серумен цитокин се определят с помощта на миши комплект BioPlex (Bio-Rad, Hercules, СА). Нивата на инсулин се измерват с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (Crystal Chem, Downers Grove, IL). Оценката на хомеостатичния модел на инсулинова резистентност (HOMA-IR) беше определена за всяка мишка (4).

Изследване за интрахепатално неутрално натрупване на липиди

Нивото на неутрални липиди (триглицериди плюс естери на холестерола), натрупани в черния дроб, се определя чрез измерване на Oil Red-O на тъканните екстракти чрез количествен анализ (16). Накратко, замразената чернодробна тъкан (100 mg) се хомогенизира и се инкубира с разтвор на Oil Red-O (0.15% Oil Red-O, 0.4% декстрин) в продължение на 60 минути. Пробите се измиват с 60% изопропанол, за да се отстрани излишното багрило, а багрилото, включено в липида, след това се екстрахира с 99% изопропанол и се определя количествено чрез измерване на абсорбцията при 520 nm (16).

Клетъчна култура

Клетъчна линия на човешки хепатом (HuH-7) (Health Science Research Resources Bank, Осака, Япония) се култивира в среда DMEM/F12 (Sigma-Aldrich) с 10% FBS при 37 ° C в 5% CO2. Освен ако не е посочено друго, HuH-7 клетките бяха предварително инкубирани за 16 h с rHDLs (крайна концентрация на apoAI, 16 μmol/l или 0,45 mg/ml), PBS (контрол), натриев салицилат (5 mmol/l) (Sigma-Aldrich), или IKK инхибитор, веделолактон (8 mmol/l) (Calbiochem, Gibbstown, NJ) и след това стимулиран с TNFα (1 ng/ml) за 24 часа. За някои клетки след 16-часова инкубация rHDL-съдържащата среда се отстранява и клетките се промиват два пъти с PBS, преди да се добави прясна среда, допълнена с TNFa (1 ng/ml) за 24 часа. Не-TNFa-стимулирани PBS-третирани клетки действаха като контроли.

Изчерпване и презареждане на холестерола

Изчерпването на холестерола се извършва чрез инкубиране на HuH-7 клетки с 1,5% метил-β-циклодекстрин за 1 h при 37 ° С. За да се извърши презареждане с холестерол, холестеролът (0,4 mg/ml) се смесва чрез завихряне с метил-β-циклодекстрин (10%) при съотношение 1:20 при 40 ° С. След инкубация на HuH-7 клетки с rHDLs в продължение на 16 часа, се извършва попълване на холестерола чрез добавяне на разтвор на холестерол/циклодекстрин, разреден при 1:25 за още един час.

Анализ на жизнеспособността на клетъчната лактат дехидрогеназа

HuH-7 клетки се инкубират в продължение на 40 часа с rHDLs (крайна концентрация на apoAI, 16 μmol/l или 0.45 mg/ml), PBS (контрола) или натриев салицилат (5 mmol/l, Sigma-Aldrich). След инкубацията клетъчната среда се събира и съхранява върху лед. След това клетките се измиват с PBS и се лизират в 1 ml вода в продължение на 20 минути при 4 ° С. След центрофугиране (1000 g, 5 минути) за утаяване и отстраняване на клетъчни остатъци, 10 μl клетъчен лизат или клетъчна среда се инкубират с 200 μl 0,15 mg/ml NADH и 2,5 mmol/l работен реагент на натриев пируват PBS. Абсорбцията при 340 nm се определя на интервали от 5 минути в продължение на 35 минути (Tecan Sunrise; Tecan Group Ltd., Mannedorf, Швейцария). Жизнеспособността се изчислява от относителната активност на лактат дехидрогеназата, измерена за средата спрямо общата активност (17).

Преходни клетъчни трансфекции и измервания на луцифераза

HuH-7 клетките бяха трансфектирани с репортерен вектор на NF-кВ-луцифераза (Promega Corporation, Madison, WI) заедно с трансфекционен контролен плазмид, pRL-TK (Promega), като се използва Effectene (Qiagen, Hilden, Германия) (18). Трансфектираните клетки бяха предварително инкубирани с rHDLs (крайна концентрация на apoAI, 16 μmol/l или 0.45 mg/ml), след това стимулирани с 1 ng/ml TNFα (rHDL + TNFα). Подгрупа от трансфектирани клетки беше предварително инкубирана с rHDLs, но rHDLs бяха отстранени от културалната среда преди активиране с TNFα (rHDL // TNFα). След третиране клетките се промиват с PBS и след това се лизират с пасивен лизисен буфер (Promega). Пробите бяха събрани, центрофугирани за отстраняване на клетъчни остатъци и след това анализирани за активност на луцифераза и ренила, използвайки двойната луциферазна репортерна система (Promega). Измерванията бяха получени с помощта на луминометър Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems, Waltham, MA).

IKK анализ

HuH-7 клетките бяха предварително обработени с rHDLs (крайна концентрация на apoAI, 16 μmol/l или 0.45 mg/ml) или PBS и след това се стимулираха с TNFa (1 ng/ml) за 15 минути. Клетките се лизират в RIPA лизисен буфер, съдържащ 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 0,5% дезоксихолат, 150 mmol/l NaCl, 50 mmol/l Tris (pH 8) и коктейл с инхибитор на протеаза (Sigma-Aldrich) . Протеиновият лизат (10 μg) се инкубира с 2 mmol/l ATP и 10 μg IKK субстратен пептид (Millipore, Billerica, MA) в реакционен буфер (8 mmol/l MOPS (pH 7), 0.2 mmol/l EDTA-Na2) при стайна температура за 90 минути. Киназа-Glo реагент (50 μl; Promega) след това се добавя към реакционната смес, инкубира се при стайна температура в продължение на 10 минути и луминесцентният сигнал се измерва на Fluoroskan Ascent FL (Thermo Labsystems).

IκB анализ

Цялоклетъчен протеинов лизат се екстрахира от HuH-7 клетки в RIPA лизисен буфер, както е описано за IKK анализа. Протеиновият лизат (100 mg) се анализира за нива на IκBα, като се използва PathScan фосфо-IκBα и общ IκBα ензимно свързан имуносорбентен анализ (Cell Signaling Technology, Danvers, MA).

NF-κB анализ за ядрена транслокация

Ядрените протеини бяха извлечени от HuH-7 клетки или чернодробни проби, използвайки комплекта за екстракция на протеини NucBuster (Merck and Co., Whitehouse Station, NJ). Ядрените протеини (100 μg) бяха анализирани, като се използва NF-κB NoShift транскрипционен фактор за анализ (Merck and Co.).

Анализ на човешки NF-κB целеви генни масиви

Обща РНК се изолира от HuH-7 клетки, използвайки реагент TRI (Sigma-Aldrich). Белязани с биотин cDNA сонди се приготвят от 10 μg обща РНК, използвайки AMV обратна транскриптаза (Promega) и биотин dUTP. След това cDNA сондите бяха хибридизирани с TranSignal NF-κB целеви генен масив (Panomics, Santa Clara, CA). Извършва се директно хемилуминесцентно изобразяване с помощта на образната система ChemiDoc XRS (Bio-Rad). Quantity One софтуер (Bio-Rad) е използван за двойно сравнително генно изразяване, след като интензитетът на сигнала се преобразува в съотношение, коригирано за фонова и референтна генна експресия. Възпроизводимостта на масива е проверена чрез RT-количествена (q) PCR за гени от интерес.

Изолиране на обща иРНК и анализ чрез RT-qPCR

Общата РНК се екстрахира от HuH-7 клетки или чернодробни проби, използвайки реагент TRI (Sigma-Aldrich) и концентрацията се нормализира до 100 ng/μl, използвайки SYBR Green II анализ (Molecular Probes, Invitrogen, Melbourne, Australia). Целостта на РНК се определя със системата Experion (Bio-Rad). cDNA беше обратно транскрибирана от обща РНК (100 ng), използвайки iSCRIPT (Bio-Rad). Експресията на гени (вж. Допълнителна таблица I за последователностите на праймерите) се усилва чрез PCR в реакционни смеси, съдържащи 12 pmol праймери и iQ SYBR Green Supermix. Усилването се извършва в термоциклер Bio-Rad iQ5, като се използва следният протокол: 95 ° C за 30 s, 60 ° C за 30 s и 72 ° C за 30 s. Относителната промяна в експресията на mRNA ген се определя чрез ΔΔCT подход (19), като се използват нива на β-2-микроглобулин (β2M) като референтен ген за човешки проби или транскрипционен фактор IID (Tbp) за миши проби.

Статистически анализ

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Значителни разлики в леченията бяха определени чрез еднопосочен ANOVA с пост-хок анализ на Bonferroni. За анализ е използван софтуер PRISM. Значимостта беше зададена на двустранна P стойност Фигура 1А ). Повишаването на телесното тегло е свързано с повишени нива на серумен триглицерид, чернодробни неутрални липиди (триглицериди плюс естери на холестерола) (допълнителна фигура IIIA, B; P фиг. 1B, C). Индуцираното от HFD нарастване на телесното тегло не се повлиява от леченията с апоАИ; той обаче потиска индуцираното от HFD повишаване на серумните нива на триглицериди, чернодробни неутрални липиди (триглицериди плюс естери на холестерола), нива на SREBP-1 и ChREBP (съответно фиг. IIIA, B и фиг. 1B, C).