Нина А. Херинг, Anja Fromm, Judith Kikhney, In-Fah M. Lee, Annette Moter, Jörg D. Schulzke, Roland Bücker, Yersinia enterocolitica влияе върху чревната бариерна функция в дебелото черво, Journal of Infectious Diseases, том 213, брой 7, 1 април 2016 г., страници 1157–1162, https://doi.org/10.1093/infdis/jiv571

върху

Резюме

Инфекцията с Yersinia enterocolitica причинява остра диария в ранна детска възраст. Модел на миши инфекция представя нови открития за патологичните механизми в дебелото черво. Симптомите включват диария с воднисти изпражнения и загуба на тегло, които имат своите функционални корелати в намалено трансепително електрическо съпротивление и повишена пропускливост на флуоресцеин. Y. enterocolitica присъства в лигавицата на мишките както на илеума, така и на дебелото черво. Тук бактериалната инсулт е от фокусно естество и води до промени в експресията и архитектурата на протеините в плътно свързване. Тези открития са в съответствие с наблюденията от предишни проучвания на клетъчни култури и предполагат механизъм на изтичане на поток от диария.

Известно е, че Yersinia enterocolitica причинява предимно остър ентерит и ентероколит, мезентериален лимфаденит или илеит при хора (йерсиниоза). Въпреки че в повечето случаи диарията, предизвикана от Y. enterocolitica, се самоограничава и отшумява в рамките на няколко дни, могат да се получат редица различни извън чревни последствия или септицемия. Тежките системни инфекции изискват антибиотична терапия.

Йерсиниозата е често срещано зоонозно хранително заболяване. Рисковите фактори за придобиване на бактериите за кърмачета и малки деца, които са по-често засегнати от възрастните, са идентифицирани като игра в пясъчник [1] ​​или контакт с домашни любимци [2]. В Германия тази информирана инфекция се е случила с честота от 4 случая/100 000 население и 48 случая/100 000 деца през 2010 г. [1]. Въпреки това, инфекцията с Y. enterocolitica се разпространява в световен мащаб с различно разпространение, специфично за щама.

Досега патологичните механизми на Y. enterocolitica се приписват главно на ексудативна диария от течащ илеум, където бактериите могат да предизвикат абсцеси от субепител. Въпреки това, ефектите върху дебелото черво са подценени и предполагаемите промени в TJ не са взети под внимание. В настоящото проучване ние имахме за цел да потвърдим нашите констатации за фокално TJ смущение, наблюдавано върху инфектирани с йерсиния монослоеве на дебелото черво.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Процедура по заразяване

Женски мишки C57BL/6 на възраст 6–8 седмици (средно тегло [± SEM], 17,7 ± 0,2 g; Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) бяха държани при условия без специфични зародиши (т.е. без специфични патогени) и експериментите бяха проведени съгласно указанията за експериментиране с животни. Мишките бяха заразени орално с 6 × 10 7 Y. enterocolitica (WA-314 pYVO8 +) [9]. Етично одобрение беше получено от местната комисия по етика за експерименти с животни (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Берлин, Германия; номер на одобрение G0732/08). Измерва се телесното тегло всеки ден и се събират фекални проби, хомогенизират се в буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) и се поставят в различни разреждания върху Yersinia селективен агар (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Германия). Животните бяха евтаназирани 2 или 5 дни след заразяването. Илеумът и дебелото черво бяха отстранени и техните дължини бяха измерени. Пробите бяха събрани директно за електрофизиологични измервания, замразени за екстракция на протеин или фиксирани в 2% параформалдехид или формалин за микроскопски анализ.

Използване на експерименти

Проби от тъкани бяха монтирани в камерите на Ussing. Еднопосочна импедансна спектроскопия и еднопосочни измервания на потока на 0,1 mM флуоресцеин (332 Da) или 0,3 mM флуоресцеин изотиоцианат (FITC) -dextran-4000 (4 kDa; Sigma-Aldrich) бяха извършени, както е описано по-горе [10].

Флуоресценция In Situ хибридизация (FISH)

Пробите от тъкани се фиксират в 3,7% (v/v) формалдехид в PBS (pH 7,4), съдържащ 50% (v/v) етанол при 4 ° C. Вграждането на проби, използвайки студена полимеризираща смола, и FISH бяха извършени, както е описано по-горе [11]. Проведени са експерименти с FISH с помощта на пан-бактериалната сонда EUB338 (biomers.net; Ulm, Германия), която се свързва с част от 16S рибозомната РНК (rRNA) компонента и безсмислената сонда NON338, за да се изключи неспецифичното свързване на сондата. За да визуализираме по-специално Y. enterocolitica, използвахме насочената към 16S rRNA FISH сонда Y.16S-69 (5′-TAAACTACTTCCCGCTGC-3 ′) [12]. Слайдовете се визуализират чрез конфокална лазерна сканираща микроскопия.

Оцветяване с хематоксилин-еозин (HE)

Пробите бяха фиксирани в 4% буфериран формалин и вградени в парафинов восък. HE оцветяването беше извършено на серийни срезове (дебелина, 3 µm).

Имунофлуоресцентно оцветяване

Имунофлуоресцентно оцветяване и последваща лазерна сканираща микроскопия бяха извършени, както беше описано по-рано [10]. Използвани са следните антитела: анти-ZO-1, анти-оклудин, анти-клаудин-5, анти-клаудин-8 (1: 100), Alexa Fluor 488 кози анти-миши или заешки IgG и Alexa Fluor 594 кози анти -миши или заешки IgG (1: 500; Invitrogen, Карлсруе, Германия). Ядрата бяха оцветени с DAPI (1: 1000).

Западно петно

Пробите от тъкани се хомогенизират чрез заливане в лизисен буфер (1 mM Tris-Cl [рН 7,4], 1 M MgCl2, 0,5 mM етилендиаминтетраоцетна киселина, 0,5 M етилен гликол тетраоцетна киселина и протеазен инхибитор коктейл; Roche, Mannheim, Германия). Уестърн блотинг се извършва, както е описано по-рано [6].

Оцветяване на апоптозата

Тъканите бяха фиксирани с 4% формалин, вградени в парафин и нарязани на 1 µm напречни сечения. След депарафинизация и демаскиране, тъканните срезове се оцветяват чрез крайно дезаксиуриотидил трансфераза-медиирано дезоксиуридин трифосфатно никелно маркиране (In-situ комплект за откриване на клетъчна смърт-флуоресцеин, Roche), както е описано по-горе [6].

Статистика

Данните се изразяват като средни стойности ± стандартна грешка на средната стойност. Статистическият анализ беше извършен с помощта на двустранен тест на Student t. P ≤ .05 се счита за статистически значим.

РЕЗУЛТАТИ

Промени в лигавичната архитектура и откриване на Yersinia enterocolitica в дисталното дебело черво на мишката 2 дни след инфекцията. A, оцветяването с хематоксилин-еозин разкрива дължините на криптите, които трябва да бъдат фокусно увеличени при заразени монослоеве (стрелки). B, Количествено определяне на дължината на криптата (P 2 срещу 87 ± 10 Ω cm 2 в контролите; P 2A). Това беше придружено от 2,5 пъти увеличение на пропускливостта за флуоресцеин (средно [± SEM], 0,52 × 10 −6 ± 0,13 × 10 −6 срещу 0,18 × 10 −6 ± 0,06 × 10 −6 cm/секунда в контролите; P −6 ± 0,05 × 10 −6 срещу 0,11 × 10 −6 ± 0,04 × 10 −6 cm/секунда в контролите; P = .07; n = 12). Измерванията на проби от илеум по време на настоящата поредица от експерименти с инфекция потвърждават намаляването на TER, съобщено по-рано от Gogarten et al [4] (данните не са показани).

Нарушаване на бариерата и тесни кръстовища (TJ) 2 дни след инфекцията. A, Приносът на епителната резистентност (R епи) и субепителната резистентност (R sub) към общата трансепителна резистентност (R t) е измерен чрез 1-пътна импедансна спектроскопия в дисталното дебело черво на мишката. Инфекцията води до намаляване на R epi и R sub, в сравнение с контролите (n = 12). B и C, представителни Western blots (B) и денситометрично количествено определяне (C) на заразено с Yersinia enterocolitica дебело черво и илеум (n = 10–12; * P epi) и субепителна резистентност (R sub) към общата трансепителна резистентност (R t ) се измерва чрез 1-пътна импедансна спектроскопия в дисталното дебело черво на мишката. Инфекцията води до намаляване на R epi и R sub, в сравнение с контролите (n = 12). B и C, представителни Western blots (B) и денситометрично количествено определяне (C) на заразено с Yersinia enterocolitica дебело черво и илеум (n = 10–12; * P Фигура 2B и 2C). Имунофлуоресцентното оцветяване на TJ протеини и последващите анализи чрез конфокална лазерна сканираща микроскопия разкриват регионално намаляване или преразпределение на клаудин-5 и оклудин. При по-голямо увеличение криптите в местата на инфектираната лигавица на дебелото черво показват дифузни TJ протеинови сигнали, изместени от TJ във вътреклетъчни отделения (Фигура 2D). Архитектурата или разпределението на claudin-8 не е променена.

ДИСКУСИЯ

Освен инфекция с видове Campylobacter или Salmonella, Y. enterocolitica е често срещана причина за хранителна бактериална диария и гастроентерит, особено при по-малки деца. Въпреки това, механизмите на индуцирана от Y. enterocolitica диария все още не са добре разбрани.

Процеси като активна секреция на аниони или зависима от натрий глюкозен транспортер малабсорбция поради инфекция с Y. enterocolitica бяха изключени в илеума на мишката [4]. Autenrieth и Firsching наблюдават образуването на абсцеси в мезентериалните лимфни възли [3], които могат да допринесат за течове. Наскоро открихме, че Y. enterocolitica нарушава епителната бариерна функция чрез въздействие върху структурата на TJ и експресията на протеини в модел на инфекция в епителните клетки на дебелото черво. Следователно в настоящото ни проучване разгледахме дали диарията, предизвикана от Y. enterocolitica в модела на мишки, е свързана с промени в TJ. Освен това се знае много по-малко за отговора на Y. enterocolitica в дебелото черво в сравнение с илеума. Дебелото черво обаче е важен сегмент за абсорбцията на вода по стомашно-чревния тракт.

В настоящото проучване ние демонстрираме, че Y. enterocolitica се открива като единични организми и в микроколонии в лигавицата на дебелото черво чрез използване на специфична FISH сонда. Бактериална инвазия и транслокация на Yersinia може да се види в илеума и проксималното и дисталното дебело черво на заразените мишки. На същия етап на инфекция, индуцираната от йерсиния бариерна дисфункция се характеризира с намаляване на епителната резистентност и увеличаване на пропускливостта на флуоресцеина. Епителната резистентност при липса на епителна апоптоза се определя главно от целостта на TJ. Известно е, че протеините TJ клаудин-5 и клаудин-8, засегнати от Yersinia в настоящото изследване, действат като силни бариерни образуващи [5]. Намалената експресия на тези 2 TJ протеини наистина може да бъде отговорна за нарушаването на епителната бариера. Интересното е, че намаляването на експресията на клаудин-8 е в съответствие с нашите констатации при епителни монослоеве, където Y. enterocolitica намалява експресията на клаудин-8 чрез намеса в c-Jun сигнализирането [6].

Трицелулинът е специализирана молекула на TJ, която ограничава преминаването на макромолекули и йони през централната тръба на триклетъчната TJ, мястото, където 3 клетки се срещат в епител [13]. Намаляването на експресията на трицелулин при заразени животни може да обясни тенденцията към увеличаване на 4 kDa пропускливост на FITC-декстран. Също така, оклудинът играе решаваща роля за TJ сигнализирането и се предполага, че задейства положението на трицелулина в трицелуларния TJ [5]. Следователно, намаляването на експресията на оклудин може също да засили пропускливостта на макромолекулата.

Оцветяването с НЕ не разкрива инфилтрация на имунни клетки в лигавицата. Следователно изглежда малко вероятно тези промени в TJ да се дължат на второ място на възпалителния отговор, тъй като той присъства при възпалителни заболявания на червата [14].

В нашите изследвания на клетъчна култура върху монослоеве на дебелото черво, ние показахме, че Y. enterocolitica нарушава епителната бариерна функция чрез регионални, прекъснато разпределени TJ промени [6]. В настоящото проучване бяха използвани микрографии FISH, за да се проучи това по-подробно и данните предполагат, че лигавицата наистина не е била равномерно засегната от патогенната обида. Също така дължината на криптата беше фокусно увеличена. Не можахме да открием глобални промени в моделите на клетъчно разпределение на TJ от имунофлуоресцентни микрографии, но можеше да се идентифицира фокално намаляване на сигналите на TJ протеин, както вече беше видно от денситометриите на Western blot. Частично преразпределение на клаудин-5 и оклудин извън TJ домена на ентероцита, функционално добавено към бариерната загуба. Отново, това е в съответствие с нашите констатации за епителни монослоеве, където Y. enterocolitica също индуцира регионални промени в TJ [6].

От това и предишни изследвания заключаваме, че Y. enterocolitica има различни патомеханизми и че инфекцията засяга не само тънките черва, но и дебелото черво. Няколко проучвания демонстрират, че Y. enterocolitica може да нахлуе в епителната бариера на илеума чрез М клетки, да се премести в пластири на Пайер и да избегне имунните клетки чрез транслокация на Yop ефекторни молекули [15]. Този патомеханизъм може да бъде от значение за разпространението на бактерии в други органи, което е предпоставка за постинфекциозни прояви. Настоящото проучване доказва, че Y. enterocolitica може също да нахлуе в лигавицата на дебелото черво, където причинява значителна бариерна дисфункция, включително различни промени в експресията и архитектурата на TJ протеин. В резултат на това разтворителите и водата могат да изтекат обратно в лумена на червата, което води до ограничен капацитет за резорбция и по-малко концентрирани изпражнения. Предполагаме, че диарията, предизвикана от Y. enterocolitica, се появява чрез механизъм на изтичане на потоци.

Бележки

Благодарности. Благодарим на Detlef Sorgenfrei († януари 2015 г.) за отличната му техническа помощ.

Финансова подкрепа. Тази работа беше подкрепена от Deutsche Forschungsgesellschaft (Schu 559/11).

Потенциални конфликти на интереси. Всички автори: Няма съобщени конфликти. Всички автори са подали формуляра ICMJE за разкриване на потенциален конфликт на интереси. Разкрити са конфликти, които редакторите смятат за релевантни на съдържанието на ръкописа.