Показатели: PDF 762 преглеждания | HTML 1204 изгледи | ?

исхемична

Андрей Тимотин, Олег Писаренко, Мария Сидорова, Ирина Студнева, Валентин Шулженко, Марина Палкеева, Лариса Серебрякова, Александър Молокоедов, Оксана Веселова, Матие Синато, Хелене Трончере, Фредерик Боал и Оксана Кундузова _

Резюме

Андрей Тимотин 1, 2, Олег Писаренко 3, Мария Сидорова 3, Ирина Студнева 3, Валентин Шулженко 3, Марина Палкеева 3, Лариса Серебрякова 3, Александър Молокоедов 3, Оксана Веселова 3, Матие Синато 1, 2, Елена Трончере 1, 2, Фредерик Боал 1, 2, *, Оксана Кундузова 1, 2, *

1 Национален институт за здраве и медицински изследвания (INSERM), Тулуза, Франция

2 Университет в Тулуза, UPS, Институт по метаболитни и сърдечно-съдови заболявания, Тулуза, Франция

3 Руски кардиологичен научно-производствен комплекс, Москва, Руска федерация, Русия

* Тези автори са допринесли еднакво за тази работа

Ключови думи: галанин (2-11), сърце, исхемия и реперфузия, енергиен метаболизъм, производство на ROS

Получено: 02 ноември 2016 г. Прието: 09 януари 2017 г. Публикувано: 03 февруари 2017 г.

Предистория и цел: Галанинът е многофункционален невропептид с плейотропни роли. Настоящото проучване е предназначено да оцени потенциалните ефекти на галанин (2-11) (G1) върху функционални и метаболитни аномалии в отговор на увреждане на миокардната исхемия-реперфузия (I/R).

Експериментален подход: Пептид G1 се синтезира по метода на 9-флуоренилметоксикарбонил (Fmoc) на твърда фаза. Химичната структура е идентифицирана чрез 1 H-NMR спектроскопия и масспектрометрия. Експериментите бяха проведени с използване на модел на плъх на I/R нараняване in vivo, изолирани сърца на перфузия плъхове ex vivo и култивирани клетки на кардиомиобласт на плъх H9C2 in vitro. Сърдечната функция, размерът на инфаркта, енергийният метаболизъм на миокарда, хемодинамичните параметри, плазмените нива на креатин киназа-MB (CK-MB) и лактат дехидрогеназа (LDH) са измервани, за да се оценят ефектите на G1 върху I/R увреждане на миокарда.

Ключови резултати: Лечението с G1 повишава жизнеспособността на клетките по дозозависим начин, инхибира клетъчната апоптоза и прекомерното производство на реактивни кислородни митохондриални видове (ROS) в отговор на оксидативен стрес в клетки H9C2. Пре- или постишемична инфузия на G1 подобрява функционалното и метаболитно възстановяване по време на реперфузия на исхемично изолирано сърце на плъх. Прилагането на G1 в началото на реперфузията значително намалява размера на инфаркта и плазмените нива на CK-MB и LDH при плъхове, подложени на I/R увреждане на миокарда.

Заключения и последици: Тези данни осигуряват първите доказателства за кардиопротективна активност на галанин G1 срещу увреждане на I/R на миокарда. Следователно, пептид G1 може да представлява обещаваща стратегия за лечение на исхемична болест на сърцето.

ВЪВЕДЕНИЕ

В настоящото изследване сме оценили ефектите на G1 върху I/R увреждане на миокарда в различни експериментални модели, включително кардиомиобласти, перфузионно изолирано сърце и сърце на място.

РЕЗУЛТАТИ

Ефектите на G1 върху оцеляването на клетките H9C2 в отговор на стрес

За да определим дали G1 влияе на клетъчната преживяемост в отговор на оксидативен стрес, ние изследвахме дозозависимите ефекти на пептида върху H2O2-индуцираната загуба на жизнеспособност на кардиомиобластите, измерена чрез концентрация на ATP. Както е показано на Фигура 1, излагането на клетки на 400 μM H2O2 в продължение на 4 часа доведе до значително намаляване на жизнеспособността на клетките в сравнение с контрола. Проучванията с отговор на дозата разкриват, че при дози от 50 и 250 пМ G1 е успял да предотврати индуцирано от H2O2 намаляване на клетъчната преживяемост. След това изследвахме чрез терминална дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP никелиране (TUNEL) анализ дали G1 влияе на апоптотичната клетъчна смърт в отговор на хипоксичен стрес. Тъй като 50 nM G1 произвеждат приблизително 20% увеличение на жизнеспособността на кардиомиобластите, ние използвахме тази концентрация в следващите експерименти. Както е показано на Фигура 2, излагането на H9C2 клетки на хипоксия причинява значително увеличение на броя на TUNEL-положителните клетки в сравнение с нормоксията. Въпреки това, лечението на клетки с 50 nM G1 значително намалява индуцираната от хипоксия апоптоза (Фигура 2A-2B).

Фигура 1: Зависим от дозата ефект на G1 върху оцеляването на клетките в отговор на оксидативен стрес. Лечението на кардиомиобласти с G1 предотвратява индуцирано от H2O2 намаляване на клетъчната жизнеспособност по зависим от дозата начин. H9C2 бяха предварително обработени с G1 (10, 50, 250 nM) в продължение на 20 минути и след това изложени на 400 μM H2O2 в продължение на 4h. Стойностите са средните стойности ± SEM за три експеримента. *** Р §§ P Фигура 2: Ефект на G1 върху индуцирана от хипоксия клетъчна апоптоза. A. Представителни флуоресцентни изображения на H9C2 клетки, предварително обработени с 50 nM G1 в продължение на 20 минути и след това изложени на нормоксия или хипоксия (1% O2), последвано от повторно окисление. Апоптозата е измерена чрез TUNEL анализ в H9C2 клетки след 16 часа хипоксия, последвана от 4 часа реоксигениране. Б. Количествен анализ на TUNEL-положителни клетки в H9C2 клетки. Стойностите са средните стойности ± SEM от три експеримента. *** Р §§§ P - ) производство с използване на флуоресцентна сонда MitoSOX Red. Както е показано на Фигура 3A-3B, излагането на клетки на хипоксичен стрес причинява значително увеличение на производството на O2 в сравнение с нормоксията. Важно е, че лечението на H9C2 клетки с 50 nM G1 значително предотвратява индуцираното от хипоксия O2 - образуване (Фигура 3A-3B).

Фигура 3: Ефект на G1 върху индуцираната от хипоксия митохондриална продукция на O2. A. Представителни флуоресцентни изображения на H9C2 клетки, предварително обработени с G1 пептид. Образуването на митохондриални O2 се оценява от MitoSOX Red в H9C2 клетки, изложени на 16h хипоксия, последвано от 4h реоксигениране. Б. Количествен анализ на митохондриален О2 - производство в клетки H9C2, изложени на нормоксия или хипоксия-реоксигенация. Стойностите са средните стойности ± SEM от три експеримента. *** Р §§§ P Фигура 4: Зависим от дозата ефект на инфузия на G1 върху функционалното възстановяване на изолирано сърце на плъх в края на реперфузията. A. Дизайн на изследването, включващ три групи: 1 - Контрол; 2 - G1 инфузия преди исхемия; 3 - G1 инфузия след исхемия; L - 5-минутна перфузия на Лангендорф при скорост на потока 4 ml/min преди или след исхемия; N, работеща перфузия по метод на Neely. Б. Ефекти на пептид G1 върху възстановяването на сърдечния дебит (CO) в края на реперфузията. ° С. Ефекти на пептида G1 върху индекса на интензивността на контрактилната функция (налягане на развитото ляво вентрикуларно ниво (LVDP) × сърдечна честота (HR)) в края на реперфузията. Стойностите са изразени като средни стойности ± SEM от 8 експеримента.

Индексите на сърдечната функция бяха сравнени в края на реперфузията за преисхемична (G1-I) и постишемична (G1-R) инфузия с оптимална концентрация G1 (240 μM) в таблица 1. В допълнение към възстановяването на CO, възстановяването на аортната продукция и ударният обем също е значително по-висок в групата G1-R в сравнение с групата G1-I. Увеличеното възстановяване на продукта LVDPxHR и в двете групи G1 се дължи на по-доброто възстановяване на HR и LVDP в сравнение с контрола. Значително увеличение на LVDP е причинено от значително намаляване на диастолното налягане на LV по време на реперфузия. И двете G1 групи показват увеличение на коронарния поток със съпътстващо намаляване на коронарното съпротивление в сравнение с контрола. Данните в таблица 1 показват, че възстановяването на сърдечната функция е по-ефективно след приложението на G1 в началото на реперфузията.

Таблица 1: Ефект от инфузията на 240 μM G1 преди (G1-I) и след глобална исхемия (G1-R) върху възстановяването на изолирани топлинни плъхове в края на реперфузията