Партньорски център за изследване на фетално програмиране, Университет на Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати, Департамент по животински и ветеринарни науки, Университет Клемсън, Клемсън, Южна Каролина, Съединени американски щати

овцете

Отделение за наука за животните, Университет на Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати

Афилиационен център за изследване на фетално програмиране, Университет на Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати, Департамент по животновъдни науки, Университет на Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати

Афилиационен център за изследване на фетално програмиране, Университет в Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати, Център за изследвания за бременност и новородено, Катедра по акушерство и гинекология, Тексаски университет, Център за здравни науки, Сан Антонио, Тексас, САЩ на Америка

Афилиационен център за изследване на фетално програмиране, Университет на Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати, Департамент по животновъдни науки, Университет на Уайоминг, Ларами, Уайоминг, Съединени американски щати

  • Нейтън М. Лонг,
  • Даниел С. Правило,
  • Nuermaimaiti Tuersunjiang,
  • Питър У. Натаниелс,
  • Стивън П. Форд

Фигури

Резюме

Затлъстяването при майките при жените се увеличава в световен мащаб. Целта на това проучване е да се оценят разликите в метаболизма на мастната тъкан и функцията при възрастни мъжки потомци от затлъстели и контролирани хранени майки, подложени на предизвикателство ad libitum хранене. Разработихме модел, при който затлъстелите овце бяха хранени със 150% от фуражите, осигурени за контрол, от 60 дни преди чифтосването. Всички овце-майки са били хранени според изискванията по време на лактацията. След отбиването, мъжкото поколение F1 е хранено само с изисквания за поддържане до зряла възраст (контрол = 7, затлъстяване = 6), когато е хранено ad libitum в продължение на 12 седмици с контролиран прием. В края на предизвикателството за хранене на потомството се дава интравенозен тест за толерантност към глюкоза (IVGTT), изважда се и се събира мастна тъкан. По време на изпитването за хранене мъжете от F1 обобе консумират повече (P 0.75). Състоянието на тялото се оценява ежемесечно, за да се оценят промените в затлъстяването. Оценка на телесно състояние от 1 до 9 е определена от двама обучени наблюдатели [19].

9 mL) се събират на всеки 2 седмици по време на изпитването за хранене в хепаринизирани епруветки (143 USP единици на 9 ml цяла кръв) в 0700 часа и кръвта се центрофугира при 2500 xg и плазмата се събира и съхранява при -80 ° C. Тяло теглата се получават на всеки 2 седмици и в края на изпитването за хранене.

За да се потвърди и по-пълно характеризира това значително въздействие на храненето ad libitum върху динамиката на инсулина и глюкозата, в края на проучването беше поставен асептично югуларен венозен катетър (Abbocath, 16ga, Abbott Laboratories, North Chicago, IL) часове преди провеждането на интравенозен тест за глюкозен толеранс (IVGTT). Вратът и раменете бяха покрити с мрежа (Derma Science Inc, Princeton NJ), за да се предотврати увреждането на катетъра. Потомството се поддържаше в съседни индивидуални кошари със свободен достъп до вода. Не е предвидена емисия

18 часа преди и по време на IVGGT, както е описано по-рано [13]. Проби от кръгла кръв (

6 ml) бяха получени в охладени хепаринизирани епруветки при -15 и 0 минути по отношение на инфузия на 0,25 g/kg интравенозен глюкозен болус (50% разтвор на декстроза; Vedco, St, Joseph, MO), прилаган в продължение на 5 секунди. Кръвни проби се събират на 2, 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 и 120 минути след вливане на глюкоза. Всички кръвни проби веднага се поставят върху лед, след това се обработват и замразяват, както е описано по-горе. След IVGGT, експерименталната дажба ad libitum продължи още 2 до 3 дни до аутопсия.

In vitro включването на ацетат в общите липиди се извършва, както е описано по-горе [21]. Трикратни проби от 100 mg прясно смлян (14 С-ацетат (Perkin Elmer Life Sciences). Инкубациите бяха проведени в 150 х 25 mm силиконизирани тръби с винтови капачки в водна баня с орбитален шейкър при 37 ° C. Реакциите бяха прекратени чрез първо изплакване на парчета тъкан със смес от бикарбонатен буфер на Krebs-Ringer и 2% BSA два пъти и общите липиди се екстрахират за една нощ с хлороформ: метанол: вода (1: 2: 0.8, обем/обем/обем). Радиоактивността в общата липидна фракция се определя от течна сцинтилационна спектроскопия. Скоростта на включване на ацетат се изразява като наномоли ацетат, превърнат в общ липид в минута. За да се изключи наличието на метаболитно активни тъкани, скоростите се изразяват в грамове липид, извлечен от тъкан, използвана в анализа. процедурата е 10,8%.

Мастната тъкан от периренални, оментални, мезентериални и подкожни депа се фиксира в 4% параформалдехид, вгражда се в парафин и се разделя на 10 μm с помощта на микротом MICROM HM310 (MICROM Inc., Walldorf, Германия), за да се получат шест секции, на разстояние 100 μm една от друга . Секциите бяха депарафинизирани и оцветени с използване на модифициран от Harris хематоксилин (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) и Eosin Y (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ). Изображенията са визуализирани с помощта на микроскоп Olympus BX50 и са заснети цифрово с помощта на камера Retiga EXiFast. Снимки с 40-кратно увеличение са направени с помощта на софтуера QED Imaging (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Избрани бяха пет произволно избрани полета за секция за общо 30 снимки на депо. Снимките бяха избрани на случаен принцип за анализ и две полета на секция бяха анализирани за диаметър на клетката от един обучен изследовател, заслепен за лечение, както е публикувано преди това с помощта на Image J Software (NIH, Bethesda, MD) [16,22]. Измервани са най-малко 1000 адипоцити на мастно депо.

Уестърн блотинг анализът е проведен с търговски антитела, както е публикувано по-рано [22]. Накратко бе извлечен протеин

200 mg пулверизирана периренална, оментална, мезентериална и подкожна мастна тъкан, като се използва ледено буфер за лизис и хомогенизатор (политрон). Хомогенатите се обработват с ултразвук и се избистрят чрез центрофугиране. Супернатантата се смесва с 2 × SDS буфер за зареждане на проби и се нагрява до 95 ° С в продължение на 5 минути. Протеиновите екстракти се разделят на 7,5 до 10% SDS-PAGE гелове и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани за имуноблотинг. Лентовата плътност се нормализира според съдържанието на β-актин.

Общата РНК беше извлечена от

500 mg прахообразна мастна тъкан, използвайки реактив Trizol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) и пречистена чрез РНК свързваща мини колона (Omega Bio-tek Inc., Norcross, GA). Една μg РНК се използва за синтезиране на едноверижна ДНК, като се използва системата за обратна транскрипция QuantiTect (QIAGEN, Inc.). Последователностите на праймера за CD36, FATP1, FATP 4, LPL са публикувани преди това от [15], GLUT 4 и AP2 от [23] и синтаза на мастни киселини (FASN) и ацетил-КоА карбоксилаза (ACC) от [24]. Количественото определяне на генната експресия за осемте гена беше изразено по отношение на 18S рРНК [25]. Експресията на 18S рРНК е средно 22,5 ± 3,2 срещу 22,9 ± 3,6 Ct за цялата мастна тъкан от Con и OB потомство.

Съставът на мастните киселини (FA) на мастните депа се определя чрез газова течна хроматография [26]. Накратко, 1 ml от 1.0 mg/ml вътрешен стандартен разтвор на три13: 0 (глицерил-тритридеканоат, Sigma Chemical Co, Сейнт Луис, Мо) в хлороформ се добавя към отделна епруветка 16 х 125 mm и се суши под азот. Тогава

100 mg прахообразна мастна тъкан се добавя към стандартизирана епруветка в два екземпляра. Метиловите естери на мастни киселини се приготвят, като се използва директна трансестерификация с 0,2 N KOH в метанол [26]. Метиловите естери на мастни киселини се разделят, като се използва Agilent 6890 GLC (Agilent Technologies, Inc, Palo Alto, Calif), снабден със стопена капилярна колона от силициев диоксид 100 m × 0,25 mm (SP-2560, дебелина на филма 0,2 μm, Supelco, Bellefonte, Pa) и детектор за йонизация на пламък. Пиковете на метилов естер на мастни киселини бяха идентифицирани чрез сравняване на времената на задържане със стандартите за метилови естери на мастни киселини (Nu-Check Prep, Inc, Elysian, MN,). Метиловите естери на мастни киселини бяха оценени с помощта на софтуера ChemStation (Agilent Technologies, Inc). Общите концентрации на FA и специфични FA са определени съгласно Murrieta et al [26].

Глюкозата се измерва колориметрично в три екземпляра (течен глюкозен хексокиназен реагент, Pointe Scientific, Inc., Canton, MI) [13]. Средната интра-пробна CV е била 1,2%, а междуаналитичната CV е 2,8%. Инсулинът беше измерен в два екземпляра от търговския RIA (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Лос Анджелис, Калифорния) в рамките на един анализ с интра-тест CV от 9,2% [13]. Концентрациите на лептин в началото и на 6 и 12 седмица от изпитването за хранене се определят с едно изследване, като се използва търговски RIA (Multispecies RIA. Linco Research, St. Charles MO), предварително потвърден с интрасайнна CV от 5,2% [13].

Всички резултати от телесното тегло на майката и телесното състояние и данните за потомството бяха анализирани с помощта на процедурата GLM на SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC) с лечение в крайния модел. Prism (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA) се използва за изчисляване на площта под кривата (AUC) за кривите на плазмената глюкоза и инсулин по време на IVGTT. Изходните концентрации на глюкоза и инсулин във всички проби преди инфузия на глюкоза бяха осреднени, за да се получат изходни концентрации. Концентрациите на плазмен хормон и метаболит на две седмици, седмични измервания на телесно тегло и плазмена глюкоза и инсулин по време на IVGTT са анализирани като повтарящи се мерки, като се използва СМЕСЕНА процедура на SAS (SAS Inst. Inc., Cary, NC) с лечение и време и тяхното взаимодействие в модел. Концентрациите на глюкоза и инсулин на гладно и AUC се анализират, като се използва GLM процедурата на SAS с лечение в модела. Годината на раждане не е оказала влияние върху данните за майката (P> 0,57) или потомството (P> 0,27) и поради това е била премахната от крайните модели, след като първоначално е била включена. Данните са представени като най-малко квадратни стойности ± SEM и разликите, считани за значими при P ≤ 0,05, с тенденция при P ≤ 0,1.

Резултати

Овцете на OB диета увеличават телесното тегло с 31% от започването на диетата до чифтосването (съответно 72,1 ± 3,7 и 94,7 ± 3,9 kg; P Фигура 1. Модел на наддаване на тегло по време на предизвикателство за хранене на мъжки потомци от овце-овце (○, n = 7 ) хранени със 100% от препоръките на NRC и овце със затлъстяване (●, n = 6) хранени със 150% от препоръките на NRC по време на бременност.

Стойностите са средни стойности ± SEM. Trt P = 0,1669, време P Фигура 2. Двуседмично плазмени концентрации на глюкоза (a), инсулин (b) и лептин (c) по време на предизвикателство за хранене на мъжки потомци от овце-овце (○, n = 7), хранени със 100% от NRC препоръки и овце със затлъстяване (●, n = 6), хранени със 150% от препоръките на NRC.

Стойностите са средни стойности ± SEM. * Средни разлики (P Фиг. 3. Плазмени отговори на глюкоза (a) и инсулин (b) при тест за толерантност към глюкоза при мъжки потомци на овце-овце (○, n = 7), хранени със 100% от препоръките на NRC и затлъстели овце (●, n = 6) хранени 150% от препоръките на NRC.

Площта под кривата (AUC) е показана във вмъкването. Стойностите са средни стойности ± SEM. а) Trt P Таблица 1. Тегло на тялото и органите, диаметри на адипоцитите, включване на ацетат на експланти на мастна тъкан на възрастни мъжки потомци, родени за контрол и затлъстели майки при аутопсия след предизвикателство за хранене ad libitum.

Диаметърът на адипоцитите е по-голям (P Таблица 2. Състав на мастната киселина (mg/g тъкан) от възрастни мъжки потомци, родени за контрол и затлъстели майки при аутопсия след период на хранене ad libitum

Таблица 1 показва скоростите на включване на 14 С маркиран ацетат в общите липиди в тъканните експланти от четирите мастни депа. Няма разлика в включването на ацетат, т.е. скорост на синтез на ново-мастна киселина в мезентериалното депо в тъканни експланти от мъже F1Con и F1OB. Изобилие на оментални, подкожни (P Фигура 4. Измервания на Western blot анализ на транслоказа на мастни киселини (CD 36), транспортер на мастни киселини (FATP) 1 и 4 и чувствителен на инсулин транспортер на глюкоза (GLUT4) в периренална (а), оментална ( б), мезентериална (в) и подкожна (г) мастна тъкан на мъжки потомци на овце-овце (отворена хистограма; n = 7), хранени със 100% от препоръките на NRC и затлъстели овце (затворени хистограми; n = 6), хранени със 150% от Препоръки на NRC.

Стойностите са средни стойности ± SEM. # средства са склонни да се различават (P Таблица 3. Съдържание на РНК изобилие от синтаза на мастни киселини и ацетил-КоА карбоксилаза, хранителни транспортери и свързани молекули в депата на мастна тъкан от възрастни мъжки потомци, родени за контрол и затлъстели майки при аутопсия след период на либитум

Дискусия

В заключение, тези данни ясно показват, че индуцираното от диетата затлъстяване на майката по време на бременност в овцете води до метаболитни промени, които продължават да съществуват в живота на възрастните. По-конкретно, потомците с ОВ имат повишен апетит, нарушена регулация на глюкозата и недостатъчност на секрецията на инсулин и резистентност към лептин, които изглежда се увеличават, тъй като тези животни остаряват, като доказателство от по-големи отговори, съобщени тук, в сравнение с тези на тези животни, отколкото е отбелязано преди [17]. Ограниченият брой животни, както и двете възрасти на животните, макар и незначителни за каквито и да е ефекти върху някое от измерванията, са ограничения за настоящото проучване. В допълнение затлъстяването при майките води до постоянно програмиране на мастната тъкан с увеличен размер на адипоцитите, повишена експресия на хранителни транспортери и увеличен синтез на FA, наблюдаван за първи път в края на бременността. Затлъстяването при майките води до потомство с множество характеристики на метаболитния синдром и тези ефекти стават по-изразени с напредналата възраст.