Принос от Джефри И. Гордън, 14 юни 2005 г.

променя

Резюме

Ние анализирахме 5088 бактериални 16S рРНК генни последователности от дисталната чревна (цекална) микробиота на генетично затлъстели ob/ob мишки, слаби ob/+ и диви братя и сестри и техните ob/+ майки, всички хранени с една и съща богата на полизахариди диета . Въпреки че по-голямата част от чревните видове на мишките са уникални, микробиотата (мишките) на мишката и човека са сходни на ниво деление (суперцарство), като доминират Firmicutes и Bacteroidetes. Съставът на микробната общност се наследява от майките. Въпреки това, в сравнение с постните мишки и независимо от родството, об/об животните имат 50% намаление в изобилието на Bacteroidetes и пропорционално увеличение на Firmicutes. Тези промени, които са общоразделни, показват, че в този модел затлъстяването засяга разнообразието на чревната микробиота и предполагат, че умишлената манипулация на структурата на общността може да бъде полезна за регулиране на енергийния баланс при затлъстели индивиди.

Въпреки че основната причина за затлъстяването е излишният калориен прием в сравнение с разходите, разликите в чревната микробна екология между хората могат да бъдат важен фактор, влияещ върху енергийната хомеостаза; т.е. лица, предразположени към затлъстяване, могат да имат чревни микробни съобщества, които насърчават по-ефективно извличане и/или съхраняване на енергия от дадена диета, в сравнение с тези общности при слаби индивиди. Тази хипотеза повдига редица основни въпроси относно микробната екология на червата при хора и мишки. Например, как се сравняват микробиотите на дисталните черва на двата гостоприемника? Родството играе ли важна роля в състава на микробната общност? Засяга ли затлъстяването структурата на общността и, ако е така, на какво таксономично ниво се появяват тези ефекти и отразяват ли досега неоценена форма на хомеостатична обратна връзка между микробиотата и енергийния баланс на приемника?

Въпреки че информацията е ограничена, настоящата концепция за бактериалното разнообразие в човешките черва е, че има ограничен набор от силно адаптирани бактерии, вероятно наследени от близкото семейство и, вероятно, филтрирани от генотипа на гостоприемника (5). Необходими са изследвания за характеризиране на правилата, контролиращи микробното разнообразие в човешките черва. Забележително е, че все още не е докладвано подробно изброяване на чревната микробиота за Mus musculus, въпреки че този вид бозайник предоставя много атрактивен модел за систематично изследване на ролите на генотипа на гостоприемника, експозицията на майката, диетата и енергийния баланс върху чревната микробна екология. Следователно, в този доклад ние използваме мишки C57BL/6, хомозиготни за мутация в лептиновия ген (ob/ob), който произвежда стереотипен, напълно проникващ фенотип на затлъстяването (6, 7), и тяхната слаба ob/+ и +/+ братя и сестри, за да се покаже, че съставът на микробната общност в дисталното черво се променя на ниво на разделение в отговор на нарастващото затлъстяване. Това откритие предоставя друга перспектива за връзката между чревната микробиота и енергийния баланс на гостоприемника.

Материали и методи

Животни. C57BL/6J ob/+ майки и техните ob/ob, ob/+ и +/+ потомци са отгледани в рамките на 12-часов светлинен цикъл, в определено състояние без патогени. Отбиващите и възрастните мишки са хранени с диета PicoLab чау (Purina) ad libitum. Всички експерименти с участието на мишки са извършени по протоколи, одобрени от Комитета за изследвания на животните във Вашингтонския университет. Всички животни бяха убити по едно и също време на деня.

PCR амплификация на 16S рРНК гени. Цеца беше възстановена веднага след убиването на мишките. Съдържанието на всяка непокътната цекум се възстановява чрез ръчна екструзия и се замразява незабавно (-80 ° C) до употреба. Замразена аликвотна част (≈100 mg) от всяка проба се добавя към епруветки, съдържащи 500 μl екстракционен буфер (200 mM Tris, pH 8,0/200 mM NaCl/20 mM EDTA), 210 μl 20% SDS, 500 μl фенол: хлороформ: изоамилов алкохол (24: 24: 1) и 500 μl циркониево-силициеви топчета с диаметър 0,1 mm (BioSpec Products, Bartlesville, OK). Микробните клетки се разрушават механично при 23 ° С с биене на зърна (BioSpec Products; инструментът е поставен на високо за 2 минути). Изолираната ДНК се фракционира чрез електрофореза чрез 1% агарозни гелове и доминиращата лента се пречиства с помощта на MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen).

За всяка мишка бяха извършени пет реплицирани 25-μl PCR, всяка съдържаща 100-200 ng пречистена геномна ДНК, 100 mM Tris (pH 8.3), 500 mM KCl, 20 mM MgSO4, 200 μM dNTPs, 200 μM концентрация на бактериите -специфичен праймер 8F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ′), 200 μM концентрация на универсалния праймер 1391R (5′-GACGGGCGGTGWGTRCA-3 ′) (8), 1 М бетаин, 800 μg/ml BSA и 1 единица Taq полимераза (Invitrogen). Условията за колоездене бяха 94 ° С за 2 минути, последвани от 20 цикъла от 94 ° С за 1 минута, 55 ° С за 45 секунди и 72 ° С за 2 минути, с краен период на удължаване от 20 минути при 72 ° С. Реплицираните PCR бяха събрани. Получените 1,3-kb ампликони бяха пречистени с гел с помощта на екстракционния комплект Qiagen и субклонирани в TOPO TA pCR4.0, последвано от трансформация в Escherichia coli TOP10 (Invitrogen). Екстракционните контроли (без добавен цекален материал) не произвеждат откриваеми PCR продукти или колонии. За всяка мишка бяха обработени 384 колонии, съдържащи клонирани ампликони за секвениране. Плазмидните вложки бяха секвенирани двупосочно чрез използване на специфични за вектора праймери.

Сглобяване на последователност, подравняване и взрив . 16S rRNA генни последователности бяха редактирани и сглобени в консенсусни последователности [phred и phrap софтуерни пакети, подпомогнати от програмата xplorseq (9)]. Последователностите, които не са сглобени, бяха изхвърлени. Бази с резултати от качеството на фрапа за подравняване на дърветата и дърво на разположение на http://gordonlab.wustl.edu/mice; обозначенията на последователностите, изброени в Таблица 1, която е публикувана като подкрепяща информация на уебсайта на PNAS), е сравнена с изданието 9 (10) на Ribosomal Database Project (RDP-II) с последователност от 47 210 и с набор от данни за човешки дебело черво на 11 831 последователност (11) с помощта на програмата взрив (12).

Консенсусните последователности бяха подравнени към набор от данни> 10 000 последователности на малки субъединици rRNA (разширена версия на базата данни, описана в реф. 13) в софтуерния пакет arb [www.arb-home.de (14)] с комбинация от автоматичното подравняване на Arb и ръчното подреждане. Хиперпроменливите региони на 16S рРНК молекулата бяха игнорирани с помощта на филтъра „lanemaskPH“, предоставен с базата данни arb (13). Подредени последователности бяха добавени към дървото за присъединяване на съседите на arb (въз основа на двойни разстояния с корекция на Olsen) с инструмента за вмъкване на парсимони. Поредиците с вътрешни региони с лошо качество, водещи до проблеми с подравняването, бяха изключени от допълнителен анализ.

Групиране на общността на мишки с unifrac . Филогенетично дърво, съдържащо само 16S рРНК последователности от това проучване, беше експортирано от arb и анотирано, за да посочи мишката за произход за всяка последователност. Информацията във филогенетичното дърво е използвана за измерване на разликата между бактериалните съобщества при мишки, като се използва метриката unifrac. Общата дължина на клона беше изчислена за бактериалната общност на всяка мишка, представена в дървото. След това за всяка възможна двойка мишки беше определена частта от общата дължина на клона, споделена от двете общности и уникална за всяка общност (unifrac). unifrac измерва степента на дивергенция между 16S rRNA последователности при сравняване на общности, без присвояване на последователности на филотипове (разпределението е необходима стъпка, когато се използват традиционни екологични индекси на общността и може да размие разликите между последователностите, като ги третира като еднакви категории).

Използвахме две пермутации на метриката unifrac. Първата пермутация анализира 16S рРНК последователности, присъстващи в проба, без да се отчита тяхното изобилие. Втората пермутация претегля дължините на клоните, базирани на относителното изобилие от последователности от всяка мишка. Използвайки двете пермутации поотделно, ние групирахме бактериалните съобщества от всяко животно, използвайки метода на нетеглените двойки с аритметична средна стойност. Устойчивостта на специфични възли в дървото, по отношение на присъствието или отсъствието на всяка мишка и покритието за вземане на проби, беше тествана с нож. И за двете пермутации на unifrac проведохме анализ на главните координати и след това използвахме ANOVA на първите две основни координати, за да определим ефекта на идентичността на майката и генотипа на ob върху състава на общността.

Също така тествахме ефекта на генотипа върху изобилието на двете най-силно представени подразделения на бактерии, Bacteroidetes и Firmicutes, контролиращи родството и пола. Последователностите, принадлежащи към всяко разделение, се изчисляват в arb и се изчислява процентът на всяко разделение, представено във всяка мишка.

Всички данни бяха проверени за нормалност с вероятностни графики преди ANOVA. ANOVA беше проведена с подход за сравнение на модели (15), като се използва програмният proc glm и контрастни кодове в софтуерния пакет sas (Версия 8, SAS Institute, Cary, NC). Използвахме отсечка от P ≤ 0,05, за да посочим значим ефект за тип II SS (равен размер на клетката) и тип III SS (неравен размер на клетката).

Таксономи и индекси на подобие, базирани на изобилие от Chao-Jaccard. Генерирана е матрица за разстояние в arb, с изключение на хиперпроменливите региони на 16S рРНК молекулата, тъй като те не могат да бъдат подравнени. Последователностите бяха разделени в таксони, въз основа на идентичност на двойки последователности, с по-ниски крайни граници от 86-99%. Използвахме индекса на подобие въз основа на изобилието на Chao-Jaccard (16), за да сравним всички възможни двойки мишки на всяко ниво на таксони (т.е. от 86% до 99% идентичност), като използвахме програмните оценки (Версия 7.5; разработена от RK Colwell) (http://purl.oclc.org/estimates).

Резултати и дискусия

Доминиране на твърдите и бактериоидите в дисталните черва на мишките. Изследвано е потомството на C57BL/6J ob/+ чифтосвания и техните три майки. Майки 1 и 3 (M1 и M3) са братя и сестри от различни котила. M2 произведе две котила, второто веднага след първото. Новородените мишки са били отглеждани заедно с майка си и съучениците до отбиването им, през третата следродилна седмица. След това мишките бяха настанени сами в клетки с микроизолатор до 8-седмична възраст, когато бяха убити. Майки са били убити на 1 година, 4 месеца след като техните котила са били убити. Братя и сестри и майки са били хранени със същата стандартна, богата на полизахариди диета с гризачи.

В съответствие с предишни проучвания, ob/ob мишките консумират 42 ± 4% повече чау, отколкото техните слаби ob/+ и +/+ братя и сестри (P 88%) от Bacteroidetes принадлежат към Bacteroidetes 4b, който няма култивиран представител (11). Протеобактерии и актинобактерии, присъстващи на ниски нива в човешката микробиота на дебелото черво и TM7, предварително идентифицирани в микробиотата на човешката уста (гингивална), всяка от които съставлява ≤1% от бактериалните съобщества на мишите цекули.

Дълбоко разклоняваща се клада на цианобактериите в червата на мишки и други животни. В допълнение към разделите, описани по-горе, открихме членове на група бактерии, които са били открити преди това в човешките и други животински черва (фиг. 1В), но не са характеризирани филогенетично. Нашият анализ разкри кохерентна свързана с червата клада, вкоренена дълбоко в цианобактериите, отдел, чиито членове извършват кислородна фотосинтеза. Тази група може да представлява потомци на нефотосинтетични родови цианобактерии, които са се адаптирали към живота в животинските стомашно-чревни пътища. Няколко последователности от други безсветли среди бяха свързани с чревната клада. Секвенирането на геномите на тези дълбоко вкоренени цианобактерии може да хвърли светлина върху голямото събитие на кислород, настъпило преди ≈2,2 милиарда години, когато цианобактериите променят дълбоко химията на земната атмосфера.

Сродството има силен ефект върху микробното разнообразие. След това сравнихме състава на бактериалната общност между мишки, като използвахме наскоро разработени изчислителни методи, които определят частта от дължината на клона във филогенетично дърво, което е уникално за всяко животно (метрика unifrac; вж. Материали и методи). Използвахме две пермутации на метриката unifrac: Първата разглежда само наличните таксони, независимо от тяхното изобилие; второто претегляне дължините на клонове въз основа на относителното изобилие от последователности от всяка мишка (вж. Материали и методи, подкрепящи резултати и фиг. 3 и 4, които са публикувани като подкрепяща информация на уебсайта на PNAS и които демонстрират прилагането на unifrac за наборът от данни за човешки дебелото черво с 11 831 членове).

Методите на unifrac бяха използвани за тестване на ефектите от родството и генотипа върху разнообразието, в съгласие със стандартните многовариантни и параметрични статистики (анализ на главните координати и метода на непретеглените двойки със средно аритметично и ANOVA, приложен към основните координати). Ние потвърдихме резултатите с анализ на приликата в общността, който взема предвид обхвата на извадките и „невидимите“ таксони. Този подход, индексът на подобие, основан на изобилието на Chao-Jaccard (16), беше приложен към таксони, ограничени от прагове за идентичност на последователността 16S rRNA, вариращи от 86% до 99%.

Резултатите разкриха, че майките и техните потомци споделят цекълни микробиоти с подобно членство в общността, независимо от техния генотип ob. Тази характеристика се запазва и за двете поколения; т.е. майки, които са братя и сестри (M1 и M3), споделят микробиоти с подобен състав, а микробиотите на техните потомци (братовчеди) са сходни. Освен това, съставът на микробиотите от две котила от една и съща майка (M2) не се различава значително, докато съставът на семейството M2 се различава значително от семейството M1/​​M3 (ефектът на родство е значителен до P 0.67, което представлява колко пъти е присъствал възелът, когато са били избрани на случаен принцип 200 последователности от всяка мишка за n = 100 повторения, с изключение на мишките M2A-1 и M2A-2, които са имали "rel =" gallery-fragment-images-370370058 "фигура с данни -caption = "

Ефекти на родството и затлъстяването върху микробната екология на червата. (A) Непретеглена двойка-група с дърво на средно аритметично (UPGMA), базирана на двойни разлики между цекалните микробни съобщества на всяка мишка (метрика UniFrac, базирана на 5088 последователности). Тъмносиньо, майка 1 и нейното потомство (M1-); розово, майка 2 и потомство; светло синьо, М3 и потомство. майки 1 и 3 са братя и сестри от различни котила. Майка 2 имаше две последователни котила (M2A- и M2B-). Всички възли са стабилни по отношение на включените специфични мишки (стойности на ножове> 0,95 за всички възли, представляващи процента от времето, през което възелът е присъствал, когато произволно избрана мишка е била отстранена от матрицата за разстояние за n = 1000 повторения). Възлите, обозначени с квадрат, са устойчиви на пореден номер (стойности на ножове> 0,67, представляващи броя на присъстванията на възела, когато от всяка мишка са избрани случайно 200 последователности за n = 100 повторения, с изключение на мишките M2A-1 и M2A-2, който имаше *, P ¶ До кого трябва да се адресира кореспонденция. E-mail: jgordonmolecool.wustl.edu .

Принос на автора: R.E.L., F.B. и J.I.G. проектирани изследвания; R.E.L., F.B. и P.T. извършени изследвания; C.A.L. и R.D.K. допринесе нови реактиви/аналитични инструменти; R.E.L., F.B., P.T., C.A.L., R.D.K. и J.I.G. анализирани данни; и R.E.L., C.A.L. и J.I.G. написа вестника.

Депозиране на данни: Последователностите, докладвани в тази статия, са депозирани в базата данни GenBank [присъединителни номера. DQ014552-DQ015671 (майки) и AY989911-AY993908 (потомство)].

Безплатно достъпен онлайн чрез опцията PNAS с отворен достъп.