Допринесе еднакво за тази работа с: Алисия Вила-Осаба, Мануел Д. Гахет

генната

Отделение за клетъчна биология, физиология и имунология, Университет в Кордоба, Кордоба, Испания, Институт за изследване на биологиката на Кордоба (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, CIBER Fisiopatología de la Oberidon, CIB Кордоба, Испания

Допринесе еднакво за тази работа с: Алисия Вила-Осаба, Мануел Д. Гахет

Отделение за клетъчна биология, физиология и имунология, Университет в Кордоба, Кордоба, Испания, Институт за изследване на биологиката на Кордоба (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, CIBER Fisiopatología de la Oberidon, NIB Кордоба, Испания

Отделение за клетъчна биология, физиология и имунология, Университет в Кордоба, Кордоба, Испания, Институт за изследване на биологиката на Кордоба (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, CIBER Fisiopatología de la Oberidon, NIB Кордоба, Испания, Медицински факултет, Университет на Илинойс в Чикаго и Медицински център по въпросите на ветераните Джеси Браун, Отдел за изследвания и развитие, Чикаго, Илинойс, Съединени американски щати

Отделение по психиатрия и поведенчески науки, Медицински факултет на Станфордския университет, Станфорд, Калифорния, Съединени американски щати

Отделение за клетъчна биология, физиология и имунология, Университет в Кордоба, Кордоба, Испания, Институт за изследване на биологията на Кордоба (IMIBIC), Университетска болница Рейна София, Кордоба, Испания

Affiliations Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, Отделение за липиди и атеросклероза, Медицински отдел, Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания

Принадлежности Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, Mammary Gland Unit, Reina Sofía University Hospital, Кордоба, Испания

Affiliations Instituto Maimónides de Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), Кордоба, Испания, отделение за липиди и атеросклерозис, Университетска болница, Университетска болница, Атеросклерозис Кордоба, Испания

‡ ‡ Тези автори са съ-старши автори на тази работа.

Отделение за клетъчна биология, физиология и имунология, Университет в Кордоба, Кордоба, Испания, Институт за изследване на биологиката на Кордоба (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, CIBER Fisiopatología de la Oberidon, NIB Кордоба, Испания

‡ ‡ Тези автори са съ-старши автори по тази работа.

Отделение за клетъчна биология, физиология и имунология, Университет в Кордоба, Кордоба, Испания, Институт за изследване на биологиката на Кордоба (IMIBIC), Университетска болница Reina Sofía, Кордоба, Испания, CIBER Fisiopatología de la Oberidon, NIB Кордоба, Испания

  • Алисия Вила-Осаба,
  • Мануел Д. Гахет,
  • Хосе Кордоба-Шакон,
  • Луис де Лесеа,
  • Ана И. Позо-Салас,
  • Франсиско Хавиер Делгадо-Листа,
  • Марина Алварес-Бенито,
  • Хосе Лопес-Миранда,
  • Раул М. Луке,
  • Жусто П. Кастаньо

Фигури

Резюме

Цитат: Villa-Osaba A, Gahete MD, Córdoba-Chacón J, de Lecea L, Pozo-Salas AI, Delgado-Lista FJ, et al. (2015) Затлъстяването променя генната експресия за GH/IGF-I ос в мастните подложки на мишките на мишки: Диференциална роля на кортистатин и соматостатин. PLoS ONE 10 (3): e0120955. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0120955

Академичен редактор: Зейн Андрюс, Университет Монаш, АВСТРАЛИЯ

Получено: 24 април 2014 г .; Прието: 10 февруари 2015 г .; Публикувано: 25 март 2015 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Тази работа е финансирана от следните безвъзмездни средства: BFU2010-19300, PI-0369-2012, BIO-0139, PI13/00651, CIBERobn (за RML и JPC) и програма „Sara Borrell“ CD11/00276 (за MDG). Ciber е инициатива на Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Sanidad, Servicios Sociales e Igualdad, Испания. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите на този ръкопис имат следните конкуриращи се интереси: RML в момента служи като асоцииран редактор на това списание. Няма конкуриращи се финансови интереси. Това не променя придържането на авторите към политиките PLOS ONE за споделяне на данни и материали.

Въведение

На GH и IGF-I също се предлага да насърчават карциногенезата на гърдата въз основа на няколко епидемиологични проучвания, показващи, че циркулиращите нива на GH и IGF-I са положително свързани с риска от рак на гърдата [16-25] сред жените в постменопауза [26]. В допълнение, in vitro и in vivo проучвания на моделни системи на гризачи и примати показват, че GH и IGF-I могат да предизвикат пролиферация и диференциация на епителни клетки на млечната жлеза, като същевременно блокират апоптозата [10]. Точната роля на оста GH/IGF-I в развитието и развитието на рака на гърдата все още не е изяснена напълно, особено в контекста на затлъстяването, метаболитен статус, който е тясно свързан с риска от рак на гърдата, поне при жени в менопауза [27–29]. Фактът, че някои компоненти на оста GH/IGF-I са променени при ксенографирани тумори на млечната жлеза от затлъстели мишки [30], засилва решаващата роля, която местната ос GH/IGF-I играе в нормалното и патологично развитие на млечната жлеза при различни метаболитни условия.

С оглед на решаващата роля на GH/IGF-I във физиологията на млечната жлеза (пато), неговата необходима взаимозависимост със системите SST/CORT/грелин и въздействието, което индуцираното затлъстяване (DIO) вероятно би имало върху локалния израз от тези регулаторни системи, ние предполагаме, че може да настъпи локална дерегулация на оста GH/IGF-1 (и/или нейните регулаторни системи) в мастните накладки на млечната жлеза при условия на затлъстяване и при липса на SST или CORT, което следователно би могло да повлияе на ( пато) физиология на млечната жлеза. Следователно, настоящото проучване имаше за цел да анализира за първи път модела на експресия на тези регулаторни системи в МФП на нокаутите CORT и SST (KO; -/-) успоредно със съответните им контролни мишки (+/+), хранени диети с ниско съдържание на мазнини (LF; постно контролиране) или с високо съдържание на мазнини (HF; затлъстяване).

Материали и методи

Животни

Всички експериментални процедури бяха одобрени от комитетите за грижа и употреба на животните към Университета в Кордоба. C57Bl/6J женски мишки са били отглеждани в домашни условия и се поддържат при стандартни условия на светлина (12-часов светлинен, 12-часов тъмен цикъл; светлини включени в 07:00 ч) и температура (22–24 ° C), със свободен достъп за чешмяна вода/храна.

Набор от мишки CORT -/-, SST -/- и съответните им контроли за отпадъци (CORT +/+ и SST +/+) мишки, генерирани от хетерозиготни размножителни двойки (n = 12 мишки/генотип), бяха хранени с LF диета (Research Diets, Gentofte, Дания; D12450B; 10% Kcal мазнини, 70% Kcal въглехидрати, 20% Kcal протеини) или високочестотна диета (Research Diets; D12492; 60% Kcal мазнини, 20% Kcal въглехидрати, 20% Kcal протеини) за 16 седмици, започвайки от 4-седмична възраст, както беше съобщено по-рано [49]. Теглото на мишките се наблюдаваше два пъти седмично. Поне една седмица преди убиването на мишките, всички те бяха обучени и обработени, за да се приспособят към персонала и методите за работа. Всички жени в случайни условия на колоездене бяха убити чрез обезглавяване без анестезия. Събира се кръв от багажника и ингвиналните MFP се събират с помощта на остри ножици, започвайки от проксималната област близо до зърното към дисталния край на жлезата към гръбначния стълб на животното, събирайки всички мастна тъкан, ограничаваща ингвиналната област на млечната жлеза съставляват хетерогенна популация от клетки, които включват мастна строма и епителни клетки, чиито пропорции могат да бъдат променени при условия на затлъстяване. Пробите незабавно се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° С до по-нататъшната им обработка.

Оценка на плазмения лептин

Кръв от багажника се събира от мишки WT, CORT-KO и SST-KO след умъртвяване и веднага се смесва с инхибитор на MiniProtease (Roche; Барселона, Испания), поставя се върху лед, центрофугира се и плазмата се съхранява при -80 ° C до определяне на лептина. Нивата на циркулиращия лептин са оценени с помощта на търговски комплект ELISA (Millipore; Мадрид, Испания).

Пълна изолация на РНК и ретротранскрипция

Общата РНК от ингвинални MFPs беше изолирана, използвайки TRIzol Reagent (Invitrogen, Барселона, Испания), следвайки инструкциите на производителя и третирана с DNase (Promega, Барселона, Испания). Количеството на възстановената РНК (преди и след третирането с DNase) се определя с помощта на спектрофотометъра NanoDrop2000 (Thermo Scientific, Wilmington, EEUU). 1 μg РНК се транскрибира обратно в cDNA, като се използват произволни хексамерни праймери [First Strand Synthesis (MRI Fermentas, Hanover, MD)].

Количествена PCR в реално време (qPCR)

Реакциите на qPCR бяха проведени с помощта на Brilliant III SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA) в системата Stratagene Mx3000p. За всяка реакция се смесват 10 μl основна смес, 0,3 μl от всеки праймер, 8,4 μl дестилирана H2O и 1 μl cDNA (50 ng) в общ обем от 20 μl. QPCR се извършва с програма, състояща се от следните стъпки: (1) 95 ° C за 3 минути, (2) 40 цикъла на денатуриране (95 ° C за 20 секунди) и отгряване/удължаване (61 ° C за 20 секунди) и (3) последен цикъл, при който крайните PCR продукти са били подложени на степенувана температурно-зависима дисоциация (55 ° C до 95 ° C, където е нараснала с 0,5 ° C/30 сек), за да се провери дали само един продукт е амплифициран. Общо РНК проби, които не са обърнати транскрибирани и не cDNA контрол са пуснати на всяка плака, за да се контролира геномно ДНК замърсяване и да се проследи потенциално екзогенно замърсяване, съответно. За да се контролират вариациите в количеството РНК, използвано в реакцията на RT, и ефективността на реакцията на RT, броят на копията на mRNA на всеки транскрипт, който представлява интерес, се коригира чрез нормализиращ фактор от два оптимални гена за поддържане на мастните накладки на млечната жлеза: β-актин и GAPDH използване на визуалното основно приложение Genorm 3.3, при което експресията на тези домакински гени не е била значително променена (данните не са показани).

Специфични праймери (Таблица 1) за транскрипции на мишки са проектирани със софтуер Primer3 и валидирани с помощта на същия параметър, докладван по-рано [50,51]. Направени са стандартни криви на всеки транскрипт, които се изпълняват успоредно с експерименталните проби, за да се определи количествено абсолютната генна експресия (номер на копие).

Статистически анализ

Пробите от всички групи в рамките на експеримент бяха обработени едновременно. Двупосочен ANOVA беше използван за сравняване на влиянието на двата фактора [диета (LF, HF) и/или генотип (WT, CORT-KO, SST-KO)] и тяхното взаимодействие, последвано от пост-хок тест на Bonferroni. Всички стойности са изразени като средна стойност ± SEM; p Фигура 1. Въздействие на LF- и HF- диетата върху телесното тегло при женски мишки WT, CORT-KO и SST-KO.

Стойностите представляват процент на нарастване на телесното тегло в сравнение със 100% от LF диети, хранени с мишки. Глобалните разлики от двупосочна ANOVA са показани в горната част на всяка графика (G: ефект на генотипа; D: ефект на диетата I: ефект на взаимодействието между генотипа и диетата; *, p Фигура 2. Плазмени нива на лептин в WT, CORT-KO и SST-KO мишки, хранени под LF и HF диети.

Стойностите представляват средна стойност ± SEM на ng/ml плазмен лептин. Глобалните разлики от двупосочна ANOVA са показани в горната част на всяка графика (G: ефект на генотипа; D: ефект на диетата I: ефект на взаимодействие между генотип и диета; *, p sst4> sst5TMD1> sst1 = sst3 (Фигура 3, средна) Обратно, естественият sst5 и лигандите (SST и CORT) в пълна дължина не се изразяват съществено в MFPs. Грелин системата се изразява и в MFP на мишки, където се установява, че вариантът In2-грелин е по-изразен от естествения грелин, докато GOAT ензимът и рецепторът на грелин (GHS-R) се експресират при пренебрежимо ниски нива (Фигура 3, долния панел).

Стойностите представляват средните стойности ± SEM на броя на копията на иРНК на всяка транскрипция (n = 5-6 мишки).

Влияние на DIO и загуба на SST/CORT върху GH/IGF-I оста в подложки на мастна мастна мишка.

За да анализираме ефекта от индуцирано от диетата затлъстяване и въздействието на SST и CORT в регулирането на експресията на GH/IGF-I, SST/CORT и грелин в MFP, използвахме женски мишки CORT- и SST-KO и техните съответни контрол, хранени с LF или HF диета (Фигура 4).

нивата на тРНК на GH-R, IGF-I, IGF-II, IGF-IR и PRL-R бяха измерени чрез qPCR. Стойностите представляват средните стойности ± SEM на номера на копие на иРНК на всеки транскрипт, коригиран от нормализиращия фактор (n = 5–6). Глобалните разлики от двупосочен ANOVA са показани в горната част на всяка графика (G: ефект на генотипа; D: ефект на диетата I: ефект на взаимодействието между генотипа и диетата; на подтипове SST/CORT/рецептор в мастните подложки на млечната жлеза на CORT-KO, SST-KO и съответните им контролни мишки.

нивата на иРНК на sst1, sst2, sst3, sst4 бяха измерени чрез qPCR. Стойностите представляват средни стойности ± SEM на броя на копията на иРНК на всеки транскрипт, коригиран от нормализиращия фактор (n = 5–6). Глобалните разлики от двупосочен ANOVA са показани в горната част на всяка графика (G: ефект на генотипа; D: ефект на диетата I: ефект на взаимодействието между генотипа и диетата; на грелин система в мастните подложки на млечната жлеза на CORT-KO, SST-KO и съответните им контролни мишки.