Допринесе еднакво за тази работа с: Hae-Jin Hu, Sin-Gi Park

променя

Affiliation TheragenEtex Bio Institute Inc., Сувон, Република Корея

Допринесе еднакво за тази работа с: Hae-Jin Hu, Sin-Gi Park

Affiliation TheragenEtex Bio Institute Inc., Сувон, Република Корея

Присъединителен център за биомедицински науки, Корейски национален здравен институт, Cheongju, Chungcheongbuk-do, Република Корея

Отделение по семейна медицина, Университет Hallym Sacred Heart Hospital, Hallym University, Gangnam, Сеул, Република Корея

Отделение по семейна медицина, Университетска болница за свещено сърце на Университета Халим, Университет Халим, Анянг, Кьонги-до, Република Корея

Отделение за семейна медицина, Институт за изследване на затлъстяването, болница Seoul Paik, Медицински колеж, Университет Inje, Сеул, Република Корея

Присъединителен център за биомедицински науки, Корейски национален здравен институт, Cheongju, Chungcheongbuk-do, Република Корея

Присъединителен център за биомедицински науки, Корейски национален здравен институт, Cheongju, Chungcheongbuk-do, Република Корея

Отдел за ентерични болести, Център за инфекциозни болести, Корейски национален здравен институт, Heungdeok-Gu, Cheongju, Република Корея

  • Хе-Джин Ху,
  • Sin-Gi Park,
  • Хан Бюл Джанг,
  • Мин-Гю Чой,
  • Парк Кюнг-Хи,
  • Дже Хеон Канг,
  • Санг Ик Парк,
  • Hye-Ja Lee,
  • Seung-Hak Cho

Корекция

4 септември 2015: Hu HJ, Park SG, Jang HB, Choi MK, Park KH, et al. (2015) Корекция: Затлъстяването променя профила на микробната общност при корейските юноши. PLOS ONE 10 (9): e0138015. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0138015 Корекция на прегледа

Фигури

Резюме

Биохимични анализи

Използвана е вакутаинерна тръба за събиране на кръвни проби от антекубиталната вена между 9:00 ч. И 11:00 ч. След 12-часово гладуване през нощта. В рамките на 30 минути плазмата и серумът се разделят и се съхраняват при -80 ° С преди по-нататъшен анализ. Нивата на триглицериди (TG), общ холестерол (Tchol), липопротеин-холестерол с висока плътност (HDL-C), hs-crp и глюкоза бяха измерени с помощта на автоанализатор (модел 7600II; Hitachi, Токио, Япония).

Вземане на проби от изпражнения и екстракция на ДНК

Проби бяха взети от всеки участник у дома. Проба от прясно изпражнение (

30 ml) се поставя в контейнер за събиране със сух лед и се донася в центъра за изследване в рамките на 12 часа. Пробата се съхранява при -70 ° С в лабораторията преди екстракция на ДНК. ДНК беше извлечена с помощта на QIAamp DNA Stool Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния), съгласно протокола на производителите. Качеството и концентрацията на ДНК са проверени с помощта на спектрофотометър Nanodrop 2000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE).

Пиросеквениране на 16S рРНК

16S рРНК генните фрагменти се амплифицират от извлечената ДНК. Следните баркодирани праймери бяха проектирани да насочват към хиперпроменливите региони (V1 до V3) в гена 16S рРНК: 9F (5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-A GAGTTTGATCMTGGCTCAG -3 '[бактерии 16rRNA праймер включва 90%]; 5 "-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-GGGTTCGATTCTGGCTCAG -3 '[Bifidobacterium 16 гРНК праймери включен 10%]; праймери целевия регион са подчертани) и 541R (5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-X-AC-ATTACCGCGGCTGCTGG -3';" X 'обозначава уникалния баркод за всяка тема) (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-GEOD-61493/protocols/). PCR се извършва, както следва: първоначална денатурация при 95 ° С в продължение на 5 минути, последвана от 30 цикъла на денатурация при 95 ° С в продължение на 30 секунди, отгряване на грунд при 55 ° С в продължение на 30 секунди и удължаване при 72 ° С в продължение на 30 секунди, с окончателно удължение при 72 ° С за 5 минути. Всяка проба беше подложена на PCR три пъти.

Качеството на PCR продукта се потвърждава чрез пускане на проба в 2% агарозни гелове, последвано от визуализация, използвайки системата Gel Doc (BioRad, Hercules, CA, USA). Амплифицираните продукти се пречистват с QIAquick PCR комплект за пречистване (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ) и се събират равни количества. Кратки ДНК фрагменти (нецелеви продукти) бяха отстранени с помощта на комплект мъниста Ampure (Agencourt Bioscience, МА, САЩ). Качеството и размерът на продуктите бяха оценени с помощта на Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, USA) и DNA 7500 чип. Смесени ампликони бяха използвани за емулсионна PCR и депозирани върху плочи Picotiter. Секвенирането беше извършено със системата GS Junior Sequencing (Roche, Branford, CT, USA) в съответствие с инструкциите на производителя.

Анализ на пиросеквенционни данни

Данните за пиросеквенцията са анализирани, както е описано по-рано [21-23]. Отчитанията бяха сортирани с помощта на уникални баркодове за всеки PCR продукт. След това последователностите от баркод, линкер и праймер бяха премахнати от първоначалното четене на последователността. Всяко четене, съдържащо два или повече двусмислени нуклеотида, тези с нискокачествен резултат (среден резултат (1), където m е броят на целевите групи, а Ntotal е общият брой примери, които удовлетворяват основата на правилата (общ брой на As в правилото, A → B) .Ng е броят на примерите, които принадлежат към прогнозираната целева група g.

статистически анализи

Микробно разнообразие във всички проби

След филтриране на последователностите на праймера и нискокачествените и химерните последователности, ние получихме общо 1 185 358 висококачествени последователности (четения) (диапазон, 2,065–42 522 четения) от 134 проби (A от Фигура A в S1 Файл). Всяка проба беше обхваната от средно 8 846 четения, което е подобно на броя на средните четения (8 427 четения), докладвани в проучване, изследващо чревната микробиота на 20 корейски индивида [16]. Въз основа на тези четения изчислихме броя на OTU, за да изследваме разнообразието на чревната микробиота. Средният брой OTUs е 356 ± 140 (диапазон, 105–876) (B от фигура A в S1 файл). Няма значителна разлика в броя на OTU между нормални и затлъстели индивиди (U-тест на Mann-Whitney, p = 0,072). В допълнение, не открихме очевидна разлика в стойностите на алфа разнообразието (индекс на Шанън) между нормални и затлъстели проби (среден брой OTUs: нормални 6,94 ± 0,49; затлъстели 6,98 ± 0,59) (Фигура В във файл S1). Също така резултатът от PCA за бета разнообразие не показва диференциален модел между нормални и затлъстели проби (Фигура C в S1 файл).

Сравнение на фекалния микробен състав

Най-вътрешният пръстен на участъците за понички както за нормални, така и за затлъстели индивиди показва състава на ниво филум, докато средният и най-външният пръстен показват състава, съответно на нивата на семейството и рода. Имаше значителна разлика в средните пропорции на Bacteroides и Prevotella между нормални и затлъстели проби на ниво род. Тази тенденция се запази на семейно ниво. Няма обаче значителни разлики в популациите на Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria в проби от нормални и затлъстели юноши на ниво филум. Показани са всички микробиоти, представляващи> 1% (средна стойност) състав.

А. Ниво на рода и Б. Семейно ниво.

A. Графични полета, показващи подобно изобилие от популациите Bacteroidetes, Firmicutes и Proteobacteria при нормални и затлъстели юноши. Б. Съотношението Firmicutes към Bacteroidetes в червата на нормални и затлъстели юноши. Няма значителна разлика в съотношението F/B между нормални и затлъстели юноши.

След това изследвахме съотношението F/B, чиято връзка с човешкото затлъстяване е неясна [17–19]. Не открихме значителна разлика в съотношението F/B между нормални и затлъстели юноши (съотношение F/B ± SD: F/B нормално = 0,50 ± 0,53; F/B затлъстяване = 0,56 ± 0,86; p = 0,384) (Фигура 3B).

Непараметричният U-тест на Mann-Whitney идентифицира и други бактериални таксони, които се различават значително по отношение на състава между затлъстелите и нормалните проби. Открихме значителни разлики в популациите на Alistipes, Faecalibacterium и Oscillibacter на ниво род (съответстващи на FDR р = 0,0125, 0,0420 и 0,0007) (Таблица 2) и в популациите Rikenellaceae, Sutterellaceae, Ruminococcaceae и Veillonellaceae семейно ниво (коригирано с FDR p = 0,0112, 0,0450, 0,0022 и 0,0450, съответно) (Таблица 3).

Асоциация между ИТМ и биохимични маркери

След това измерихме корелацията между таксоните на ниво род (въз основа на петте таксона, показващи статистически значими разлики в състава между затлъстели и нормални юноши на ниво род) и BM-z-резултата или нивата на биохимични маркери (Таблица 4). В съответствие с предишни наблюдения установихме, че популациите Bacteroides и Prevotella са значително свързани с BM-z-score (p Таблица 4. Асоциация между състава на чревната микробиота и z-score на индекса на телесна маса (BMI) и биохимични маркери според R на Pearson (p-стойност).

TG, Tchol и hs-crp показват отрицателна корелация с дела на Bacteroides (p = 0,0049, 0,0023 и 0,0038, съответно), докато HDLc показва положителна корелация (p = 0,0165). За разлика от това, TG и hs-crp показват положителна корелация с популацията на Prevotella (p = 0,0394 и 0,0150, съответно). Популацията на Oscillibacter показа отрицателна корелация с hs-crp, макар и с по-малко значение (p = 0,0360).

Копаене на правила за асоцииране

Дискусия

Тук изследвахме фекални проби от 67 затлъстели и 67 нормални корейски юноши, за да идентифицираме връзката между състава на чревната микробиота и детското затлъстяване. Използвахме QIAamp DNA Stool Kit за извличане на ДНК, защото този комплект показва висока ефективност, когато се използва с различни протоколи [31, 32]. Изследване, което сравнява механични и ензимни методи за екстракция на ДНК, показва, че механичното разрушаване на клетките води до по-голямо бактериално разнообразие и подобрява ефективността на екстракцията на ДНК [33]. Микробиотата обаче е силно подобна, независимо от използвания метод на екстракция.

Установихме, че съставът на микробиотата в проби от нормални юноши е в съгласие със съобщеното в проучване, което изследва чревната микробиота на 20 корейски индивида на ниво филум [16] и проучване, което изследва чревните ентеротипи при корейски монозиготни близнаци [34]. Въпреки че две от 20-те корейски проби са от деца, можем да предположим, че нормалните корейски юноши и възрастни имат сходен чревен микробен състав, поне на ниво филум. Резултатите от изследването на корейски монозиготни близнаци показват, че микробиотата на здрави корейци се групира в два ентеротипа, които са доминирани или от Bacteroides, или от Prevotella. Тези ентеротипове обаче не са в значителна корелация с биомаркери като възраст, ИТМ, кръвно налягане, Tchol или TG. Само един биомаркер, серумна пикочна киселина, е различен между двата ентеротипа [34].

Много изследвания се опитват да идентифицират връзката между състава на чревната микробиота и затлъстяването [7-11, 35]. Някои резултати са последователни, докато други са противоречиви. Например, не открихме значителна разлика в съотношението F/B между затлъстелите и нормалните юноши, което е в съответствие с проучване на Karlsson et al., [17], който изследва това съотношение при затлъстели и слаби деца в предучилищна възраст. За разлика от това, едно испанско проучване [19] и едно белгийско проучване [18] съобщават за повишено съотношение F/B при затлъстели деца. Като се има предвид, че връзката между състава на чревната микробиота и затлъстяването изглежда се различава в зависимост от възрастта и географското местоположение [13-16], можем да предположим, че резултатите от тези изследвания могат да се отнасят само за конкретни популации и за конкретни възрастови групи. Предполагаме, че несъответствията се дължат на сложните връзки между генетични, екологични, технически и/или клинични фактори. Следователно ще са необходими по-интегративни подходи, за да разберем напълно тази сложна асоциация.

Също така открихме, че размерът на популацията на Bacteroides е отрицателно свързан с нивата на TG, Tchol и hs-crp (p = 0,0049, 0,0023 и 0,0038, съответно), но положително свързан с HDLc (p = 0,0165); тези резултати обаче не са съгласни с тези на Bervoets et al., които са изследвали чревния микробиотен състав при 26 затлъстели и 27 слаби деца на възраст 6-16 години [18]. Те не откриха значителна връзка между популацията на Bacteroides и биохимични маркери като глюкоза, HDLc или Tchol; те обаче откриха положителна връзка между Lactobacillus и плазмените нива на hs-CRP (p = 0,007). Не е ясно дали разликата между резултатите от тяхното проучване и нашето собствено се дължи на по-малкия размер на извадката или на популационните разлики.

Скорошни проучвания изследваха връзката между бактериалния състав и диетата. De Filippo et al. показа, че фекалните общности в африканските деца в селските райони са различни от тези в европейските деца [15]. Африканските деца, които консумират диета с ниско съдържание на мазнини и протеини и богата на растителни храни, имат значително обогатена популация на Bacteroidetes и изчерпана популация на Firmicutes в сравнение с европейските деца. Други изследвания също показват, че обогатеният с Prevotella ентеротип е свързан с диета с високо съдържание на въглехидрати [18, 40], докато обогатеният с Bacteroides ентеротип е свързан с диета с високо съдържание на протеини и животински мазнини [41]. Тези резултати предполагат, че промените в диетата предизвикват промени в чревната микробиота. Въпреки че не можахме да оценим ефектите от режима на хранене и чревния микробен състав върху затлъстяването в настоящото проучване, ние вярваме, че това трябва да бъде взето предвид при бъдещи задълбочени проучвания. В допълнение, настоящото проучване е с дизайн на напречно сечение. Следователно са необходими допълнителни проспективни проучвания, за да се определят напълно причинно-следствените връзки между чревната микробиота, диетата и затлъстяването.

подкрепяща информация

Файл S1.

Фигура А, Брой четения на последователност и оперативни таксономични единици (OTU). А. Брой четения на проба. Б. Брой OTU на проба. Фигура Б, Алфа разнообразие (индекс на Шанън) на оперативните таксономични единици. Индекс на Шанън за всяка проба. Фигура В, График за анализ на основните компоненти на бета разнообразие за нормални и затлъстели индивиди. Таблица А, Правила за асоцииране, генерирани от копаенето на правила за асоцииране, използвайки 28 различни рода.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: SHC HJL. Изпълнява експериментите: MGC KHP JHK. Анализирани данни: SHC HJH SGP. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: SHC HBJ SIP. Написа хартията: SHC HJH.