Резюме на научна статия по биологични науки, автор на научна статия - Алисън Д. МакНейли, Дейвид П. Макфарлейн, Емет О’Флаерти, Зора Е. Ливингстън, Тияна Митич и др.

Подобни теми на научна статия по биологични науки, автор на научна статия - Алисън Д. МакНили, Дейвид П. Макфарлейн, Емет О’Флаерти, Зора Е. Ливингстоун, Тияна Митич и др.

Академичен изследователски труд на тема "Жлъчните киселини модулират глюкокортикоидния метаболизъм и оста хипоталамус-хипофиза-надбъбреците при обструктивна жълтеница"

ЕВРОПЕЙСКА АСОЦИАЦИЯ ЗА ИЗСЛЕДВАНЕ НА ЧЕРНИЯ ЧЕРЕН дроб I

киселини

СПИСАНИЕ ПО ХЕПАТОЛОГИЯ

Жлъчните киселини модулират глюкокортикоидния метаболизъм и хипоталамо-хипофизно-надбъбречната ос при обструктивна жълтеница

Алисън Д. Макнийли1 '*, Дейвид П. Макфарлейн1, Емет О'Флаерти1, Зора Е. Ливингстън1, Тияна Митич1, Кърсти М. Макконъл1, Скот М. Маккензи2, Елинор Дейвис2, Ребека М. Рейнолдс1, Хеле К. Тиесън3, Оле Скотт3, Брайън Р. Уокър1, Рут Андрю1

1 Ендокринологичен отдел, Център за сърдечно-съдови науки, Институт за медицински изследвания на Queen, Университет в Единбург, 47 Little France Crescent, Единбург EH16 4TJ, Великобритания; 2MRC Група за кръвно налягане, Център за сърдечно-съдови изследвания в Глазгоу, Университет в Глазгоу, 126 University Place, Глазгоу G12 8TA, Великобритания; 3 Физиология и фармакология, Университет на Южна Дания, DK-5000 Odense C, Дания

Предшестващо състояние и цели: Потискането на оста хипоталамус-хипотария-надбъбречна жлеза възниква при цироза и холестаза и е свързано с повишени концентрации на жлъчни киселини. Изследвахме дали това е било медиирано чрез жлъчни киселини, действащи да влошат стероидния клирънс чрез инхибиране на метаболизма на глюкокортикоидите от 5р-редуктаза.

Методи: Ефектът на жлъчните киселини върху метаболизма на глюкокортикоидите е изследван in vitro в чернодробни субклетъчни фракции и хепатомни клетки, което позволява количествено определяне на кинетиката и изобилие от транскрипти на 5р-редуктаза. Впоследствие метаболизмът се изследва in vivo при плъхове след диетична манипулация или лигиране на жлъчните пътища. И накрая, глюкокортикоидният метаболизъм беше оценен при хора с обструктивна жълтеница.

Резултати: При чернодробния цитозол на плъхове хенодезоксихолевата киселина конкурентно инхибира 5р-редуктазата (К 9,19 ± 0,40 iM) и намалява изобилието от транскрипти (в клетки H4iiE) и промоторна активност (репортерна система, HepG2 клетки).

При плъхове Wistar диетичната хенодеоксихолова киселина (1% w/w chow) инхибира чернодробната 5p-редуктазна активност, намалява отделянето на 3a, 5p-тетрахидрокортикостерон в урината и намалява надбъбречното тегло. Обратно, диетата без мазнини потиска нивата на жлъчните киселини и повишава активността на 5p-редуктаза в черния дроб, допълването на диетата без мазнини с CDCA намалява активността на 5p-редуктаза и

Ключови думи: жлъчна киселина; Глюкокортикоид; 5р-редуктаза; Надбъбречна жлеза; Жълтеница. Получено на 2 август 2009 г .; получено в преработен вид на 30 септември 2009 г .; приета на 15 октомври 2009 г .; на разположение онлайн 4 март 2010 г.

qFunding: Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от благотворителния тръст, Британска сърдечна фондация, Дружество за ендокринология, Съвет за медицински изследвания, Датска сърдечна фондация и Датско дружество по хипертония. * Автора за кореспонденция. Тел .: +44 1382 496589; факс: +44 1382 633923. Имейл адрес: [email protected] (A.D. McNeilly). Съкращения: HPA, хипоталамо-хипофизарно-надбъбречна; ACTH, адренокортикотропен хормон; 3aHSD, 3a-хидроксистероид дехидрогеназа; FXR, фарнезоиден X рецептор; Cyp7a1, холестерол 7а-хидроксилаза; 11pHSD, 11 р-хидроксистероид дехидрогеназа; BDL, лигиране на жлъчните пътища; THB, тетрахидрокортикостерон; DHB, дихидрокорт-икостерон; GCMS, масова спектрометрия с газова хроматография; CDCA, хенодеоксихолева киселина; СА, холова киселина; DCA, дезоксихолова киселина; GCDCA, глико-CDCA; К инхибиторна константа; TCDCA, tauro-CDCA; DMEM, модифицирана среда на Dulbecco на Eagle; PCR, полимеразна верижна реакция; FF, без мазнини; ECRP, ендоскопска ретроградна холангиопанкреатография; ANOVA, дисперсионен анализ; ALT, аланин трансаминаза; ALP, алкална фосфатаза; Cyp11b1, 11p-хидроксилаза; NEFA, неестерифицирани мастни киселини; SEM, стандартна грешка на средната стойност.

урина 3a, 5ß-намален кортикостерон. Холестазата при плъхове потиска чернодробната 5ß-редуктазна активност и изобилието на транскрипти.

При осем жени с обструктивна жълтеница относителната екскреция на 3a, 5ß-тетрахидрокортизол с урината е значително по-ниска, отколкото при здравите контроли.

Заключение: Тези данни предполагат нова роля на жлъчните киселини в инхибирането на чернодробния глюкокортикоиден клирънс с достатъчна величина за потискане на активността на оста на хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза. Повишените чернодробни жлъчни киселини могат да обяснят надбъбречната недостатъчност при чернодробни заболявания.

Активирането на оста хипоталамус-хипофиза-надбъбречна жлеза (HPA) и засиленото освобождаване на кортизол е от решаващо значение за успешния отговор на стреса, но този хомеостатичен механизъм е нарушен при чернодробни заболявания. При цироза нарушената реакция на надбъбречната жлеза към ACTH допринася за повишена смъртност с хемодинамично увреждане [1,2]. Заместването с ниски дози хидрокортизон значително подобрява разрешаването на шока и оцеляването [3]. По същия начин при холестатичните плъхове секрецията на кортикотропин-освобождаващия хормон се потиска и надбъбречните реакции на стреса са нарушени [4]. Причината за нарушена регулация на оста HPA не е разбрана.

Ако метаболизмът на кортизола е нарушен, тогава контролът с отрицателна обратна връзка на оста HPA води до потискане на нивата на АСТН, атрофия на надбъбречната жлеза и намалена скорост на производство на кортизол, модел, наблюдаван и при цироза [5,6]. Тъй като черният дроб е основното място на метаболизма на кортизола [7], нарушеният клирънс на кортизол при чернодробно заболяване може да бъде причинен от намалената функционална чернодробна маса или от инхибитор на глюкокортикоидния метаболизъм.

Чернодробните ензими, които инактивират глюкокортикоидите, включват 5а- и 5р-редуктази и 3а-хидроксистероид дехидрогеназа (3aHSD), които превръщат кортизола в тетрахидрометаболити [8]. В допълнение, 5p-редуктаза и 3aHSD участват в синтеза на жлъчна киселина [9]. Жлъчните киселини са цитотоксични, така че тяхното образуване и елиминиране са строго регулирани чрез повишаване на регулацията на гените, кодиращи протеини, които индуцират тяхната детоксикация и/или

екскреция и чрез потискане на гени (главно чрез фарнезоидния X рецептор (FXR)), кодиращи протеини, които регулират катаболизма на холестерола, например холестерол 7а-хидроксилаза (CYP7A1) [9].

Инхибирането на бъбречните 11pHSD2 от жлъчните киселини нарушава инактивацията на глюкокортикоидите [10,11] и допринася за задържането на натрий и загубата на калий, наблюдавани при цироза и холестаза [12], както и след лигиране на жлъчните пътища (BDL) [13], чрез незаконно заемане на минералокортикоидни рецептори от излишък на кортизол. Жлъчните киселини също инхибират чернодробните 11pHSD1 [8,14-16], предотвратявайки реактивирането на глюкокортикоидите. Ефекти върху метаболизма на глюкокортикоидите, различни от 11 pHSD, не са изследвани, въпреки че е доказано инхибиране на 5b-редукцията на алдостерон от жлъчните киселини [17].

Ние предположихме, че натрупването на жлъчна киселина при холестаза инхибира чернодробната 5b-редуктаза, допринасяйки за нарушен глюкокортикоиден клирънс и затихване на активността на HPA ос. Ефектите на жлъчните киселини върху активността и транскрипцията на чернодробна 5р-редуктаза са изследвани in vitro в черния дроб и в хепатомните клетки. Ефектът на жлъчните киселини върху активността на HPA се оценява in vivo при плъхове след диетична манипулация [18] или BDL. Глюкокортикоидният метаболизъм е изследван и при хора след запушване на общия жлъчен канал от камъни в жлъчката.

Материали и методи

Източници, освен ако не са посочени: разтворители (Rathburn, Walkerburn, UK), реагенти за клетъчна култура (Gibco BRL, Paisley, UK), реагенти за молекулярна биология (Promega, Southampton, UK), химикали (Sigma-Aldrich, Poole, UK), радиохимикали (GE) -Здравеопазване, Ейлсбъри, Великобритания).

Ефекти на жлъчните киселини върху ензимната кинетика in vitro

Всички експерименти следваха указанията на Министерството на вътрешните работи, Великобритания или Датската инспекция за опити с животни. Мъжки плъхове Wistar (9 седмици; Harlan Olac, Bicester, Великобритания) бяха умъртвени чрез обезглавяване (08:00 ч.) В рамките на 60 s от обезпокояване.

[3H] 4-тетрахидрокортикостерон (5b-THB) (5b-редуктазна активност) се генерира в чернодробен цитозол (100 ig/ml протеин), инкубира се 4 часа с [3H] 4-кортикостерон (25 nM), кортикостерон (975 nM, IC50; 0,01-1000 iM, кинетика) и NADPH-генерираща система [19]. Превръщането на 5р-дихидрокортикостерон (5р-DHB; 2 iM) в 5р-THB (активност 3aHSD) беше измерено след инкубация (10 минути), както по-горе. 5p-THB се определя количествено чрез мас-спектрометрия с газова хроматография (GCMS) [20].

Към инкубациите се добавят жлъчни киселини (хенодеоксихолова киселина (CDCA), холева киселина (CA), дезоксихолова киселина (DCA), глико-CDCA (GCDCA) или тауро-CDCA (TCDCA), (10-2-10-9M). Инхибиране. на скоростта (IC50) се изчислява спрямо контролите без жлъчна киселина. Стойностите на Kj се изчисляват чрез глобален модел на конкурентно инхибиране (Kmapp = Km * (1 + № Y = Vmax * X/(Kmapp + X), използвайки CDCA в неговата IC50.

от RPCI-11 HS BAC клон 386M10 (Invitrogen, Великобритания). Генерирана е конструкция с помощта на PCR амплификация с висока точност, като се използват следните олигонуклеотиди, включващи Kpn място (подчертано) и потвърждаващо секвениране.

5'AKR1D1 (-383), GGTACCAGTCCTGCTGCATCCAAATC;

3'AKR1D1 (+446) GGTACCTGTGGAGAACCTGACTGTAGGA.

Амплимери бяха вмъкнати в многократното място за клониране на репортерния вектор за луцифераза на светлината на светулка pGL3-Basic и тяхната ориентация беше потвърдена. Макси ДНК препарати от луциферазната конструкция бяха приготвени с помощта на Qiagen maxi комплекти (Crawley, UK).

Клетъчната линия на човешкия хепатобластом, HepG2 (ATCC, Rockville, USA), се култивира в DMEM, допълнена с фетален телешки серум, L-глутамин и пеницилин, както по-горе. Плазмидна ДНК (

10 ig) се трансфектира [22] в клетки, заедно с pCH110 плазмид (2 ig; p-галактозидаза (p-Gal), Amersham, UK). CDCA (50 iM) или етанол се добавя 24 часа след трансфекцията. Активността на луциферазата се изследва в клетъчни лизати 72 часа след трансфекцията [23]. Ефективността на трансфекцията се оценява чрез p-Gal активност, изследвана с помощта на комплекта Tropix Galacto-Light (Cambridge Bioscience, Великобритания). Експериментите бяха проведени в три екземпляра три пъти, използвайки повече от един препарат на плазмид.

Ефекти на жлъчните киселини in vivo при плъхове Диетично манипулиране на жлъчните киселини

Мъжки плъхове Wistar (4-6 седмици; n = 8/група) бяха настанени единично (6 дни). В първия протокол животните получават стандартна чау ± CDCA (1% тегл./Тегло, 4 седмици). Във втората те получиха диета без мазнини (D05052506; Research Diets Inc, САЩ) ± CDCA (1% т/т; D05052507) вместо това.

Ежедневното производство на глюкокортикоиди се изследва в урината от животни, настанени в метаболитни клетки в продължение на 6 дни, след 3 седмици по съответните им диети. Само в първия протокол отговорите на сдържания стрес са проучени след 2,5 седмици диета. Животните се аклиматизират за работа (7 дни) и след това се поставят в ограничителни тръби (20 минути, 08:00) и се връщат в нормалните клетки. Кръв се получава при 0 (непосредствено преди задържане) и при 20, 40, 60 и 90 минути след задържане.

Лигиране на жлъчните пътища (BDL)

Общият жлъчен канал е лигиран при мъжки плъхове Wistar (n = 6/група; M&B Ejby, Дания) или плъхове, подложени на фалшива операция. Плъховете бяха жертвани чрез обезглавяване след 7 седмици, когато бяха очевидни жълтеница и хепатоспленомегалия и настъпи декомпенсирана чернодробна недостатъчност [13].

Измервания ex vivo

Ензимните активности се определят при следните субстратни концентрации: 5р-редуктаза (25 пМ, 1 пМ) и 3aHSD (1 тМ). Количествената оценка на плазмената и чернодробната биохимия и уринарните стероиди е [19,20,24,25]. Количествените киселини бяха количествено използвани с помощта на комплект за обща жлъчна киселина (Trinity Biotech, Ирландия) [26], а чернодробните функционални тестове бяха количествено използвани с модулен P анализатор (Roche Diagnostics, Швейцария). Транскриптите на 5р-редуктаза и Cyp11b1 са количествено определени чрез qPCR [19,27] и са нормализирани съответно до 18S РНК или р-актин (Applied Biosystems). Изобилието на транскрипт на Cyp7a1 е количествено определено чрез анализ на Northern blot [24] и е нормализирано до U1 (M14386) [19].

Ефект на жлъчните киселини върху изобилието на транскрипти в култивирани клетки

H4iiE клетки (ECACC, Великобритания), се поддържат в модифицираната среда на Dulbecco на Eagle (DMEM, Invitrogen, UK), допълнена с фетален телешки серум (10% v/v), пеницилин (100 IU/ml), стрептомицин (100 ig/ml) и L-глутамин (2 mM) (37 ° C, овлажнен въглероден диоксид: въздух (5:95)). Клетките се прехвърлят в прясна среда 1 час преди добавянето на жлъчна киселина (100 iM) или носител (етанол, DCA> СА (фиг. 1А-С). Жлъчните киселини и техните конюгати не инхибират 3aHSD (14.29 ± 2.53 Control vs 13,25 ± 3,02 CDCA; 13,87 ± 4,41 TCDCA; 18,44 ± 0,76 GCDCA nmol/mg/h). CDCA е конкурентен инхибитор на 5b-редуктаза (фиг. 1D).

Ефекти на жлъчните киселини върху нивата на иРНК на метаболизиращите ензими in vitro

CDCA намалява изобилието на транскрипт на 5b-редуктаза (фиг. 2А) и Cyp7a ", но не и на 3aHSD. CDCA също потиска активността на промотора на 5b-редуктаза (фиг. 2В).

Ефекти от добавянето на CDCA при плъхове върху стандартната чау диета (Таблица l)

CDCA повишава общото съдържание на жлъчна киселина в плазмата и изпражненията и намалява чернодробната иРРНК Cyp7al. CDCA намалява телесното тегло, но не и теглото на черния дроб или съдържанието на гликоген. CDCA има тенденция да намалява съдържанието на чернодробни триглицериди (p = 0,06) и намалява плазмената глюкоза и инсулин и повишава плазмения HDL холестерол. Третираните със CDCA животни са имали по-висок серумен ALT спрямо контролите, но не показват промяна в ALP или албумин.

■ CDCA xTCDCA o GCDCA o DCA a CA

-5 -4 -3 -2 -1 -9 -8 -7 Концентрация на трупи (M)

IC50 (mM) 5ß-редуктаза

CDCA 2,7 ± 0,2 DCA 78,1 ± 1,9 * # CA 665 ± 4,6 * GCDCA 2,3 ± 0,3 TCDCA 1,7 ± 0,03

Фиг. 1. Инхибиране на 5р-редуктаза от жлъчните киселини. 5р-Намаляване на кортикостерона в присъствието на (A) CDCA, CA, DCA (B) CDCA, GCDCA, TCDCA. Скорост срещу контрол (100%), без жлъчни киселини. (C) IC50 на реакциите. (D) Lineweaver-Burke парцели, показващи конкурентно инхибиране на 5р-редуктаза от CDCA (отворени квадрати: 2,5 х 10-6 М) (срещу превозно средство (напълнено)). Средно ± SEM; n = 5. 'p 0,10, r 0,20, r