Юнг Ън Лий

2 Катедра по гръдна и сърдечно-съдова хирургия, Национална университетска болница Кьонсанг, Медицинска гимназия на Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

киселина

Чин-ок Йи

1 Катедра по анатомия, Институт по здравни науки, Медицински факултет на Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Byeong Tak Jeon

1 Катедра по анатомия, Институт по здравни науки, Медицински факултет на Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Хюн Джо Шин

1 Катедра по анатомия, Институт по здравни науки, Медицински факултет на Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Су Кионг Ким

3 Катедра по вътрешни болести, Национална университетска болница в Кьонсан, Медицинско училище в Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Tae Sik Jung

3 Катедра по вътрешни болести, Национална университетска болница в Кьонсан, Медицинско училище в Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Джун Йънг Чой

2 Катедра по гръдна и сърдечно-съдова хирургия, Национална университетска болница Кьонсанг, Медицинска гимназия на Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Гу Сеоб Ро

1 Катедра по анатомия, Институт по здравни науки, Медицински факултет на Националния университет в Кьонсан, Джинджу, Кьоннам, Република Корея

Резюме

Заден план

Хипергликемията води до сърдечен оксидативен стрес и дисбаланс в глюкозната хомеостаза. Диабетната кардиомиопатия се характеризира със сърдечна хипертрофия и фиброза. Основните механизми на диабетната кардиомиопатия обаче не са напълно изяснени. Това проучване има за цел да изследва ефектите на алфа-липоевата киселина (ALA) върху сърдечния енергиен метаболизъм, антиоксидантния ефект и фиброзата в сърцата на плъховете на Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF).

Методи

Животните бяха разделени на недиабетни Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) плъхове и предразположени към диабет OLETF плъхове с или без приложение на ALA (200 mg/kg/ден) в продължение на 16 седмици. Диабетната кардиомиопатия се оценява чрез оцветяване със Sirius Red. Ефектът на ALA върху AMPK сигнализирането, антиоксидантните ензими и свързаните с фиброза гени в сърцето на плъхове OLETF са извършени чрез Western blot анализ или имунохистохимия.

Резултати

Western blot анализ показва, че сърдечната аденозин монофосфат-активирана киназа (AMPK) е по-ниска при OLETF плъхове, отколкото при плъхове LETO, и че лечението с ALA повишава сигнализацията при плъхове OLETF. Освен това ниската антиоксидантна активност при плъхове OLETF се увеличава чрез лечение с ALA. В допълнение към увеличеното оцветяване на Sirius в червено на колаген, трансформиращият растежен фактор -β1 (TGF-β1) и растежният фактор на съединителната тъкан (CTGF) се изразяват при по-високи нива в сърцата на плъхове OLETF, отколкото в сърцата на LETO плъхове, и нивата на тези фактори са намалени с ALA.

Заключения

ALA засилва AMPK сигнализирането, антиоксидантния и антифиброгенен ефект. Констатациите на тези тези предполагат, че ALA може да има благоприятни ефекти при лечението на диабетна кардиомиопатия.

Заден план

Необходима е постоянна скорост на митохондриален синтез на АТФ и усвояване на глюкоза, за да може сърцето да се свива непрекъснато [1]. Дисрегулирането на сърдечния енергиен метаболизъм и инсулиновата резистентност причинява морфологични промени в миокарда [2]. По-специално, предишни проучвания показват, че периваскуларната и/или интерстициалната фиброза са най-изявените структурни промени на миокарда при пациенти с диабет [3]. Въпреки известната връзка между енергийния метаболизъм и инсулиновата резистентност в сърцето на диабета, механизмът, лежащ в основата на развитието на диабетната кардиомиопатия, остава да бъде изяснен.

Адипонектинът е адипокин, който има антидиабетни и антиатерогенни ефекти [4]. Хипоадипонектинемията води до сърдечен оксидативен стрес и нарушаване на регулирането на хомеостазата на глюкозата [5]. Адипонектинът също се синтезира и секретира от човешки и миши кардиомиоцити [6]. Адипонектинът в инсулиновата резистентност корелира с активирането на аденозин монофосфат-активираната киназа (AMPK) сигнален път, който е замесен в окисляването на мастните киселини и усвояването на глюкозата. AMPK е метаболитен сензор за стрес или ефектор, който контролира енергийната хомеостаза в клетката. AMPK се фосфорилира и активира от чернодробна киназа B1 (LKB1) в отговор на увеличаване на съотношението AMP/ATP [7]. Активираният AMPK фосфорилира и инактивира ацетил коензим А карбоксилаза (ACC), който участва в окисляването на мастните киселини [8]. При мишки с дефицит на адипонектин намалената AMPK сигнализация в сърцето се свързва с повишена сърдечна хипертрофия [9].

Дисфункционалната активност на AMPK намалява експресията на антиоксидантния ген и индуцира възпаление и производството на оксиданти [10]. Изобилието от оксиданти е тясно свързано с инсулиновата резистентност. Свръхпроизводството на реактивни кислородни видове (ROS) се предизвиква от хипергликемия, дислипидемия, напреднали крайни продукти за гликиране (AGEs) и липидни пероксиди [11]. По-специално, производството на ROS в митохондриите се увеличава в сърцето с диабет, което води до намален метаболизъм на сърдечната енергия [12].

Алфа-липоевата киселина (ALA) първоначално е идентифицирана като задължителен кофактор за митохондриалните α-кетокиселини дехидрогенази и е установено, че играе важна роля в енергийния метаболизъм на митохондриите [13]. ALA подобрява използването на глюкоза в изолирани сърца на плъхове [14]. Нарастващите доказателства сочат, че ALA поддържа клетъчния антиоксидантен статус чрез повишаване или индуциране на усвояването на антиоксидантните ензими [15]. Администрацията на ALA намалява съдържанието на AORT в аортата, производството на сърдечен митохондриален супероксид и инсулиновата резистентност при модели на животни с диабет [16].

Следователно целта на това проучване беше да се изследват ефектите от диетичното приложение на ALA върху AMPK сигналния път и върху ROS, свързани с развитието и прогресирането на диабетната кардиомиопатия.

Материали и методи

Животни

Склонни към диабет мъжки плъхове Otsuka Long-Evans Tokushima (OLETF) (на възраст 4 седмици) и недиабетични контролни плъхове Long-Evans Tokushima Otsuka (LETO) са получени от фармацевтичната компания Otsuka (Токушима, Япония) и поддържани в животното съоръжение в Националния университет Gyeongsang (Република Корея). Всички експерименти са извършени в съответствие с Националните здравни насоки за използване на лабораторни животни. Университетският комитет за грижа за животните за изследване на животните към Националния университет в Кьонсан одобри протокола за изследване. Плъховете LETO и OLETF бяха настанени индивидуално с редуващ се 12-часов цикъл светлина/тъмнина. Плъховете OLETF (на възраст 12 седмици) бяха разделени на случаен принцип в две групи (n = 9–10 на група) и бяха хранени със стандартна чау с или без ALA (200 mg/kg/ден, Bukwang Pharmaceutical Company, Сеул, Южна Корея) в продължение на 16 седмици. Плъховете LETO бяха хранени със стандартна чау без ALA. Всички плъхове се претеглят непосредствено преди умъртвяването на 28-седмична възраст.

Събиране на тъкани и подготовка на проби

За анализ на тъканите плъховете се упояват със Zoletil (5 mg/kg, Virbac Laboratories, Carros, Франция) и след това се перфузират транскардиално с хепаринизиран физиологичен разтвор, последван от 4% параформалдехид в 0,1 М фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Сърцата бяха фиксирани със същия реагент за 12 часа при 4 ° С. След това пробите се обработват за вграждане на парафин и се изрязват участъци с дебелина 5 μm. Срезите бяха оцветени с хематоксилин и еозин (H&E). Секциите бяха визуализирани под светлинен микроскоп BX51 (Олимп, Токио, Япония), а цифровите изображения бяха заснети и документирани.

Червено оцветяване на Сириус

Червеното оцветяване на Сириус обикновено се използва за идентифициране на колагени. За да се определи сърдечното натрупване на колаген, депарафинизираните сърдечни секции бяха оцветени с хематоксилин на Weigert (Sigma-Aldrich, MO, USA) в продължение на 8 минути, измити и повторно оцветени с пикро-сириус червено (Sigma) в продължение на 1 час и измити. Секциите бяха дехидратирани чрез сортирани алкохоли, изчистени в ксилол, покрити с покривно стъкло и запечатани с Permount (Sigma).

Анализ на колаген на Sircol

Анализът на колагена Sircol е метод за свързване на багрилото, предназначен за анализ на киселини и пепсин-разтворими колагени, които са новосинтезирани по време на възпаление и зарастване на рани. Сърдечните тъкани се замразяват в течен азот и се съхраняват при -80 ° С преди анализа. Концентрацията на колаген се анализира с помощта на комплект за анализ на Sircol (Bioclor Ltd., Северна Ирландия, Великобритания), съгласно инструкциите, предоставени от производителя. Изведена е стандартна крива и се изчислява съдържанието на колаген в пробата.

Имунохистохимия

Депарафинизираните сърдечни секции се поставят в разтвор от 0,3% H2O2 за 10 минути. След измиване срезовете се третират с разреден блокиращ кози серум в продължение на 20 минути. Слайдовете се инкубират през нощта при 4 ° С в овлажнена камера с анти-мишка-Cu/Zn-супероксид дисмутаза (SOD) (1: 100, Santa Cruz Biotechnology, USA), разреден в блокиращ серум. След промиване три пъти с 0,1 М PBS, срезовете бяха инкубирани за 1 h при стайна температура с вторично антитяло (1: 200). След измиване срезовете се инкубират в разтвор на комплекс авидин-биотин-пероксидаза (ABC разтвор, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Разделите бяха разработени с 0,05% диаминобензидин (DAB, Sigma), съдържащ 0,05% H2O2, и бяха дехидратирани чрез сортирани алкохоли, изчистени в ксилол, покрити с покривно стъкло и запечатани с Permount (Sigma). Секциите бяха визуализирани под светлинен микроскоп BX51 (Olympus). За имунооцветяване на фактор на растеж на колагеновата тъкан (CTGF) сърдечните секции бяха инкубирани със заешки анти-плъхов CTGF (1: 500, Abcam, Cambridge, MA, USA) за една нощ при 4 ° С. Секциите се инкубират с конюгирано с AlexaFluor 594 магарешко анти-заешко антитяло (1: 1,000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Флуоресценцията се визуализира под конфокален микроскоп (FV-1000, Olympus).

Цитозолна и ядрена фракция

За цитозолни и ядрени фракции сърцата бяха незабавно изрязани и поставени в ледено студен PBS. След нарязване в ледено студен лизисен буфер (10 mM HEPES-KOH [pH7.9], 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 1 μg/ml апротинин, 3 μg/ml пепстатин, 0.5 μg/ml левпептин, 0.2 mM PMSF, 0,5 mM DTT), сърцата се хомогенизират. Фракциите на сърцето са приготвени според Андрюс и Фалер [17].

Мембранно фракциониране

Сърцата бяха незабавно изрязани и поставени в студено PBS. След нарязване в ледено студен хипертоничен лизисен буфер (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 mM натриев ванадат, 5 μg/ml апротинин, 3 μg/ml пепстатин, 5 μg/ml левпептин, 1 mM EDTA, 1mM DTT), сърцата бяха хомогенизирани. Хомогенатите се центрофугират при 12 500 х g за 15 минути. Получената пелета се ресуспендира в 1% буфер за лизит на Тритон и се центрофугира при 12 500 х g за 15 минути.

Western blot анализ

За пълни сърдечни екстракти замразените сърца се хомогенизират в реагент за екстракция на протеин на тъкан T-PER (Thermo scientitic, IL, USA), съдържащ коктейл за инхибитор на Halt протеаза (Thermo scientitic). Използвани са следните антитела: LKB1 (Wako Pure Chemical Company, Осака, Япония); фосфо-AMPK, AMPK, фосфо-ацетил-CoA карбоксилаза (ACC), ACC, стерол-свързващ елемент, регулиращ протеин-1 (SREBP-1, BD Biosciences, Калифорния, САЩ), глюкозен транспортер 4 (GLUT4, Cell Signaling Technology, Danvers, Масачузетс, САЩ), рецептор за крайни продукти за напреднало гликозилиране (RAGE), хем оксигеназа-1 (HO-1), Cu/Zn-SOD и трансформиращ растежен фактор -β1 (TGF-β1) (всички от Santa Cruz Biotechnology) . Мембраните се сондират с всяко антитяло или α-тубулиново антитяло (Sigma) и се визуализират с помощта на усилен хемилуминесцентен субстрат (Pierce, Rockford, IL, USA). Програмата за анализ на изображения Multi-Gauge V 3.0 (Fujifilm, Токио, Япония) е използвана за измерване на плътността на лентата.

Статистически анализ

Значение: * P † P (Фигура 1А). 1 А). Нивата на сърдечна експресия на LKB1 са били значително по-ниски при плъхове OLETF, отколкото при плъхове LETO (р (Фигура 1В). 1 В). Western blot анализ показва, че нивата на сърдечен фосфо (p) -AMPK и p-ACC при плъхове OLETF са по-ниски, отколкото при плъхове LETO и че те се увеличават след приложението на ALA (p (Фигура 1C 1 C и D). В сравнение с LETO плъхове, Western blot разкри, че има увеличение на прекурсорния сегмент на експресията на SREBP-1 както в общия, така и в цитозолния лизат OLETF плъхове приблизително до 1,42 и 4,51 пъти, съответно (Фигура (Фигура 1C). 1 C). Също така, зрял сегмент на SREBP -1 се увеличава при плъхове OLETF в сравнение с плъхове LETO. Въпреки това, лечението с ALA намалява експресията на SREBP-1 в общия брой и ядрените лизати от сърцето на плъхове OLETF (съответно 1,24 и 2,76 пъти, p (Фигура 1D). 1 D). Лечението с ALA повишава транслокацията на GLUT4 от вътреклетъчните места към плазмената мембрана.