Мелани Чатхурика Дабарера

Катедра по биохимия, Факултет по медицински науки, Университет на Шри Джаеварденепура, Гандогавила, Нугегода, Шри Ланка

пептиди

Лохини В. Атитан

Катедра по биохимия, Факултет по медицински науки, Университет на Шри Джаеварденепура, Гандогавила, Нугегода, Шри Ланка

Расика П. Перера

Катедра по биохимия, Факултет по медицински науки, Университет на Шри Джаеварденепура, Гандогавила, Нугегода, Шри Ланка

Резюме

Въведение:

Извараните (Dadhi) пептиди намаляват хипертонията чрез инхибиране на ангиотензин конвертиращия ензим (ACE) и серумния холестерол. Пептидите варират в зависимост от бактериалните видове и вида мляко, използвани по време на ферментацията.

За изолиране и анализ на антихипертензивните пептиди, преди и след храносмилането, в две търговски марки извара в Шри Ланка.

Материали и методи:

Суроватка (Dadhi Mastu), отделена чрез високоскоростно центрофугиране, се изолира с помощта на течна хроматография с високоефективна обратна фаза (HPLC). Елуираните фракции се анализират за АСЕ инхибиторна активност, използвайки модифициран метод на Cushman и Cheung. Пробите от извара се подлагат на ензимно разграждане с пепсин, трипсин и карбоксипептидаза-А при оптималното им рН и температура. Пептидите, изолирани с помощта на HPLC с обратна фаза, бяха анализирани за АСЕ инхибиторна активност.

Резултати:

Суроватъчните пептиди и от двете марки дават сходни модели (седем основни и пет малки пика) в HPLC профила на елуиране. По-малката концентрация на пептиди е по-висока при марка 1, а пента-октапептидите при марка 2. Пентапептидът има най-висока АСЕ инхибиторна активност (марка 2–90% и марка 1–73%). След храносмилането се получават ди и три пептиди със сходни инхибиторни модели и при двата, които са по-високи, отколкото преди храносмилането. Получени са тринадесет фракции, където девет фракции показват повече от 70% инхибиране и при двете марки с 96% инхибиране на АСЕ за дипептид.

Заключение:

Изварата има АСЕ инхибиторни пептиди и активността се увеличава след храносмилането.

Въведение

Диетата играе важна роля за насърчаване и поддържане на добро здраве. Съвременната тенденция в хранителната индустрия е към развитието на функционални храни със здравословни свойства. В тази връзка, пептидите могат да се използват като хранителни съставки за профилактика или контрол на кръвното налягане. Един от най-важните рискови фактори за сърдечно-съдови заболявания е високото кръвно налягане или хипертония. Кръвното налягане се контролира от различни биохимични пътища. [1]

Системата ренин-ангиотензин-алдостерон е ключова цел за борба с хипертонията. Ангиотензин-конвертиращият ензим (ACE) действа в тази система. Този ензим е цинкова металопептидаза, която превръща биологично неактивен полипептид, наречен ангиотензин I, до мощния вазоконстриктор, известен като ангиотензин II. Освен това, АСЕ катализира разграждането на брадикинин, понижаващо кръвното налягане нонапептид в инхибирането на активността на АСЕ на системата каликреин-кинин, води до антихипертензивен ефект. [1] АСЕ инхибиторите имат ефект и върху ренин-ангиотензиновата система, като инхибират производството на вазоконстриктор Ang II. [2]

Антихипертензивните пептиди, получени от храни, са по-безопасни и тези инхибиторни пептиди могат да бъдат освободени чрез протеинова хидролиза или ферментация. [1] АСЕ инхибиторните пептиди са идентифицирани в различни храни; един от основните източници на тези пептиди са млечните протеини. Протеиновата фракция на млякото се състои от 80% казеин, а останалите 20% са суроватъчни протеини (α-лакталбумин, β-лактоглобулин и имуноглобулини). [3]

Биологично активните пептиди се произвеждат чрез ензимна хидролиза на протеини или протеолитична активност на бактериите по време на микробна ферментация на млякото. Микроорганизмите могат да образуват АСЕ инхибиторни пептиди, като казокинини и лактокинини и други пептиди по време на ферментацията. Тези пептиди оцеляват в червата и се абсорбират в кръвния поток. Проучванията in vitro показват, че млечните пептиди имат инхибиторен ефект върху АСЕ активността. [4]

Катаболизмът на лактозата в млякото от Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus и Bifidobacteria води главно до производството на млечна киселина или млечна и оцетна киселини, когато Bifidobacteria се използват в закваската. [5] Съобщава се, че организмите, произвеждащи киселина във ферментирали млечни продукти, могат да удължат живота на потребителя. Но някои хора вярват, че яденето на млечни продукти може да доведе до атерогенен липиден профил. Изследванията са доказали, че ферментиралите храни съдържат живи бактерии, които влияят върху химичния състав на ферментиралия продукт, особено млечни протеини, които водят до късоверижни мастни киселини. [3] Допълнителни късоверижни мастни киселини като оцетна киселина, пропионова киселина и маслена киселина имат инхибиране на обратната връзка за ензима 3-хидрокси-3-метилглутарил-коензим Редуктаза, който регулира стъпката, ограничаваща скоростта в синтеза на холестерол и намалява нивата на серумния холестерол . [3] Намаляването на серумния холестерол намалява образуването на атеросклеротична плака. Не само ферментиралото мляко, други протеини като соевите протеини също имат понижаващ холестерола ефект. [6]

Изварата (Dadhi) е ферментирал млечен продукт и е обичайна диета от древни времена, която осигурява различни ползи за здравето. [7] Според Аюрведа консумацията на извара ускорява храносмилането (Agni), стимулира вкусовите рецептори и действа като предястие. Той е идеален за употреба при състояния като загуба на вкус, дизурия и хроничен ринит. Тъй като абсорбира вода от червата, той се използва широко за лечение на диария и дизентерия и смекчава Вата Доша. Изварата има високо съдържание на калций и дава на непоносимите към лактоза организми цялото хранително съдържание на млякото. [8]

Материали и методи

Приготвяне на суроватка

Наличните в търговската мрежа две марки извара, закупени от местния супермаркет (три проби от всяка марка), бяха центрофугирани при 6000 об/мин при 4 ° C [4] с помощта на лабораторна центрофуга (Sigma 3K30) и беше получена фракцията на суроватката.

Разделяне на пептиди в суроватка чрез високоефективна течна хроматография с обратна фаза

Суроватката се елуира в линеен градиент от 100% разтворител А (0,1% трифлуорооцетна киселина в дейонизирана вода) до 80% разтворител В (0,1% трифлуороцетна киселина в ацетонитрил) в продължение на 60 минути при скорост на потока от 1 мл/мин в високоефективна течна хроматография с обратна фаза (HPLC) (серия Agilent 1200). [4,10] Елуираните фракции се наблюдават при 215 nm [4,10] и 1 ml фракции се събират всяка минута за ACE инхибиторен тест. Те бяха съчетани с пептидна стандартна смес (Sigma H2016) и на Ile-Pro-Ile пептиден стандарт (Sigma 19759), които бяха елуирани със същия градиент на разтворител.

Анализ на пептиди

Качествен анализ беше извършен при стайна температура (30 ° C) чрез съпоставяне на времето на задържане на пиковете на суроватката спрямо времето на задържане на пептидните стандарти в HPLC профили (Agilent 1200, DAD G1315B). Количествен анализ беше направен чрез изчисляване на площта под кривата в HPLC пикове.

Пептиди от смилана извара

Всяка пробна извара се смесва добре и се подлага на последователно ензимно разграждане с пепсин, трипсин и карбоксипептидаза А при оптималното им рН и температура в продължение на 24 часа. [3] Разградената извара се центрофугира и се получава филтрат. Филтратът беше подложен на HPLC с обратна фаза (C18, силициев диоксид, Agilent 1200, детектор DAD G1315B) при стайна температура (30 ° C), използвайки същия градиент на разтворителя като суроватката.

Измерване на инхибиторната активност на ангиотензин конвертиращия ензим

АСЕ инхибиторната активност на всяка фракция е измерена съгласно метода, описан от Cushman и Cheung. [11] Фракциите бяха събрани и всяка фракция от пептиден разтвор (100 μl) беше инкубирана с 20 μl разтвор на Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine (0.3% w/v), който беше предварително инкубиран при 37 ° С в продължение на 15 минути. Реакцията се инициира чрез добавяне на 50 μl АСЕ, разтворени в дейонизирана вода (0,1 U/mL), и сместа се инкубира в продължение на 15 минути при 37 ° С. Реакцията беше спряна чрез добавяне на 250 μl 1N HCI. Накрая се добавят 2 ml етилацетат и разтворът се разбърква енергично в продължение на 60 s и се центрофугира при 2000 rpm в продължение на 2 минути, за да се получи ясно разделяне. Пипетира се един милилитър обем от прозрачния горен слой. Тези епруветки се поставят във водна баня и се добавя 1 ml деионизирана вода, след като етилацетатът се изпари. Абсорбцията се записва при 228 nm върху празна проба, която съдържа неактивния ензим с помощта на ултравиолетов спектрофотометър. [3]

Изчисления

Степента на инхибиране от пептидите на събраните фракции от HPLC се изчислява, като се използва следното уравнение:

Стандартно: Абсорбция само с ACE

Проба: Абсорбция с АСЕ и АСЕ инхибиторни пептиди

Празно: Абсорбция без ACE.

Резултати

Седем основни пика (1–7) и пет малки пика (i-v) бяха наблюдавани в HPLC профила на елуиране на суроватката и за двете марки [Фигури [Фигури1 1 и и2]. 2]. Тези пикове се сравняват с моделите на елуиране на пептидни стандарти. Tyr-Gly-Gly-Phe-Met (Sigma H2016), Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (Sigma H2016) и Ile-Pro-Ile (Sigma 19759) пептидни стандарти, съвпадащи с двете марки [Фигура 3]. Пептидът с най-висока АСЕ инхибиторна активност е пентапептид и при двете марки с марка 2 с 90% инхибиране и марка 1 със 73% инхибиране. Последователността на пентапептида съвпада точно със стандарта Tyr-Gly-Gly-Phe-Met. При марка 2 четири фракции дават повече от 50% инхибиране на АСЕ, докато при марка 1 две фракции дават инхибиране над 50%. Концентрациите на аминокиселини и дипептиди са по-високи при марка 1, а концентрациите на пента до октапептид са по-високи при марка 2 [Таблица 1].