Резюме

Въведение

Чернодробният гликоген действа като запас на енергия по време на хранителна достатъчност, за да се използва по време на нужда. Метаболизмът на този полизахарид в черния дроб се контролира от дейностите на два ключови ензима: гликоген синтаза (GS) и гликоген фосфорилаза (GP) (1). GS се фосфорилира на множество места, което предизвиква инактивирането му, докато GP се активира чрез фосфорилиране на едно място. И двата ензима също се регулират алостерично (2,3).

храна

Субединиците, насочени към гликоген, се свързват с гликоген и протеинова фосфатаза 1 (PP1) и улесняват дефосфорилирането на GS и GP, като по този начин активират първите и инактивират вторите. Шест гена кодират субединици, насочени към гликоген (4). Сред тях е доказано, че протеинът, насочен към гликоген (PTG) (PPP1R3C или PPP1R5), който се експресира в много тъкани, контролира запасите от гликоген в различни животински модели (5-7).

Аденовирусната свръхекспресия на PTG в черния дроб на нормални плъхове увеличава гликогена и подобрява глюкозния толеранс, без да нарушава липидния метаболизъм (8). В подход, фокусиран върху диабета, Yang и Newgard (9) показват, че аденовирусната експресия на PTG в черния дроб на STZ-диабетични плъхове повишава съдържанието на гликоген и обръща хипергликемията и хиперфагията. Чрез различен подход съобщихме, че чернодробната аденовирусна експресия на активна форма на чернодробна GS (LGS), която също повишава съдържанието на гликоген, при плъхове със STZ-диабет намалява приема на храна и хипергликемия (10).

Russek (11) беше първият, който предложи хепатостатична теория за приема на храна, която беше допълнително предефинирана като гликогеностатичен модел от Flatt (12). Този модел прогнозира, че хората консумират храна до ниво, което поддържа нивата на гликоген в тялото (12). Всъщност много редове експериментални доказателства установяват корелация между размера на запасите на чернодробен гликоген и приема на храна (13,14); други резултати обаче аргументират тази хипотеза (15-17). Резултатите в Yang and Newgard (9) и Ros et al. (10) подкрепят схващането, че чернодробният гликоген е фактор, контролиращ приема на храна при хиперфагични животни с диабет тип 1. Тези проучвания обаче са ограничени от използването на аденовирусна трансдукция в животински модели, които ограничават експерименталния период до 1 седмица. В настоящото проучване изследвахме дали трайното увеличаване на запасите от гликоген в черния дроб регулира приема на храна. За тази цел генерирахме мишки, които свръхекспресират PTG специално в черния дроб (PTG OE), което води до трайно увеличаване на чернодробния гликоген и ги хранехме или със стандартна диета, или с високо съдържание на мазнини (HFD). Храненото с HFD животно е подходящ модел за изследване на нарушен глюкозен толеранс и диабет тип 2 (18), а продължителното поглъщане на HFD е свързано с прекомерна консумация и затлъстяване (19).

Ние показваме, че когато се хранят с HFD, животните с PTG OE имат намален прием на храна и имат по-ниско телесно тегло и мастна маса от контролните животни. Тези резултати идентифицират запасите от чернодробен гликоген като регулатор на приема на храна в модел на хиперфагия и затлъстяване и предполагат, че стратегиите за увеличаване на чернодробния гликоген могат да осигурят възможност за лечение на диабет и затлъстяване.

Изследователски дизайн и методи

За генериране на мишки, които свръхекспресират PTG, конструирането на вектор за насочване и насочена към сайта трансгенна стратегия са проектирани и изпълнени от genOway (Лион, Франция). Накратко, PTG кДНК под контрола на вездесъщия промотор на CAG (цитомегаловирусен незабавен ранен усилвател/сливане на пилешки β-актинов промотор) се въвежда в безвреден локус чрез хомоложна рекомбинация. LoxP-фланкирана транскрипционна спирачна касета беше включена между CAG промотора и PTG cDNA, за да позволи експресията да зависи от действието на Cre рекомбиназа. Получената линия на мишката се развъжда с животно, експресиращо албумин промотор Cre рекомбиназа (The Jackson Laboratory), което насочва експресията на PTG специално към черния дроб. Всички изследвани мишки са били сънародници. Мишките бяха поддържани на 12: 12-часов цикъл светлина-тъмнина със свободен достъп до вода и хранени със стандартна диета (Harlan Laboratories) или с HFD (45% ккал мазнини; каталог # D12451; Research Diets) в продължение на 16 седмици, започвайки от 6-седмична възраст.

Биохимичен анализ на кръвта и черния дроб

Съдържанието на гликоген в черния дроб се определя чрез анализ на базата на амилоглюкозидаза, както е описано другаде (20). LGS активността се определя, както е описано по-рано в присъствието или отсъствието на Glc-6-P (10). GS активността, измерена в присъствието на наситен Glc-6-P [(+) Glc-6-P], съответства на общото количество ензим, докато измерването в негово отсъствие [(-) Glc-6-P] е индикация за активната (нефосфорилирана) GS форма. Съотношението на активност (-) Glc-6-P/(+) Glc-6-P (съотношение на активност GS) е оценка на състоянието на активиране на ензима. Вътреклетъчната концентрация на АТФ се измерва от екстракти от перхлорна киселина на черния дроб, използвайки предварително описания флуориметричен метод (21). Триглицеридите в черния дроб се определят количествено, като се използва триацилглицериден комплект (Sigma-Aldrich) в 3 mol/L KOH и 65% етанолови екстракти въз основа на метода, описан от Salmon and Flatt (22) за осапуняване на черния дроб. Нивата на кръвната глюкоза бяха измерени с помощта на глюкомер (Ascensia Breeze2; Bayer HealthCare). Серумните концентрации на β-хидроксибутират (Sigma-Aldrich), триацилглицериди (Sigma-Aldrich) и нестерифицирани мастни киселини (Wako) бяха измерени спектрофотометрично. Плазменият инсулин и лептин са анализирани чрез ELISA (Crystal Chem).

Тестове за толерантност към глюкоза и инсулин

За тестове за толерантност към глюкоза (GTT), на гладно през нощта (16 часа) мишките се инжектират с глюкоза 2 g/kg i.p. От върха на опашката се взема пълна кръв за измерване на глюкозата. In vivo глюкозно стимулираната секреция на инсулин се определя в отделни експерименти. За тестове за толерантност към инсулин (ITT), на мишките на гладно в продължение на 6 часа се инжектира инсулин 0,75 единици/kg i.p. и гликемията се измерва от кръвта от опашката, взета в посочените часове след инжектирането.

Препарати за РНК и количествена RT-PCR

Подготовка на тъкани, екстракция на РНК, RT-PCR и количествени PCR анализи в реално време бяха извършени, както е описано (23). Следните комплекти праймери/сонди TaqMan (Applied Biosystems, Мадрид, Испания) бяха използвани за количествена RT-PCR: PTG (Mm01204084_m1), Hprt (Mm00446968_m1), пируват киназа (Pklr) (Mm00443090_m1), синтаза на мастни киселини (Fasn2) (Mas1) ), ацетил CoA карбоксилаза (Acc1α) (Mm01304257_m1), SREBP1 (Mm00550338_m1), активиран от пероксизома пролифератор (PPAR) γ (Mm01184322_g1), моноацилглицерол O-ацилтрансфераза 1 (Mm00mg150) Ucp1 (Mm01244861_m1), Ucp2 (Mm00495907_g1), Ucp3 (Mm00494077_m1), PPARα (Mm00440939_m1), Fgf21 (Mm00840165_g1), невропептид Y (NPY), Mnom0c Mm01231183_m1), ацил-CoA оксидаза (Acox1) (Mm01246834_m1) и Ppia (Mm02342429_g1). Ppia се използва като домакински ген в черния дроб. Hprt се използва като домакински ген в хипоталамуса и кафявата мастна тъкан.

Непряка калориметрия, прием на храна и телесна температура

Индиректната калориметрия се извършва с помощта на осемкамерна система Oxymax (Columbus Instruments) за измерване на производството на топлина, което се изчислява от консумацията на кислород и производството на CO2. Мишките бяха оставени да се аклиматизират в клетките за 2 дни преди един или два цикъла от 24-часови измервания. Разходът на енергия се изчислява като (3.185 + 1.232 × RER) × VO2 (24), където RER (коефициент на дихателен обмен) = VCO2/VO2. Глюкозно окисление (в g/min/kg 0,75 = [(4,545 × VCO2) - (3,205 × VO2)]/1 000) и окисляване на липидите (в g/min/kg 0,75 = [1,672 × (VO2 - VCO2)]/1 000 ) бяха изчислени. Амбулаторната и общата локомоторна активност се наблюдава чрез метод на прекъсване на лъча на инфрачервената фотоклетка. Телесната температура се определя с помощта на термометър за ректална сонда за животни (Cibertec). За проследяване на приема на храна, мишките се настаняват индивидуално и се аклиматизират в продължение на 1 седмица преди проучването. Приемът на храна се измерва ежедневно в продължение на 5 последователни дни. Епидидималната мастна тъкан се отстранява и се приготвя в парафин след фиксиране в 10% фосфатно буфериран формалин. След това бяха извършени петна от хематоксилин-еозин. За да се измери размерът на адипоцитите, общата площ на адипоцитите беше проследена ръчно и анализирана. Белите области на адипоцити бяха измерени в ≥100 клетки на мишка във всяка група.

Маслено червено O оцветяване

Чернодробните тъкани бяха вградени в съединение с оптимална температура на рязане (Sakura Finetek) и замразени. Замразените тъкани се нарязват на криосекции с дебелина 5 μm и се оцветяват с Oil Red O (Sigma-Aldrich).

Статистика

Данните са изразени като средна стойност ± SEM. Стойностите на P бяха изчислени, като се използва несдвоен тест на Student t, двупосочен ANOVA или трипътен ANOVA с post hoc тестове на Tukey, както е подходящо. P OE) (вж. Дизайн и методи за изследване). Нивото на иРНК на PTG в черния дроб на тези мишки е 12 пъти по-голямо от това на контролните животни (фиг. 1А). Както се очакваше, LGS беше активиран, защото PTG, чрез насочване на PP1 към гликогенната частица, поддържа GS и GP в дефосфорилирано състояние (7). Както се очакваше, LGS беше активиран при тези мишки (фиг. 1В).

Характеризиране на мишки със специфична за черния дроб свръхекспресия на PTG, хранени със стандартна диета или HFD. Контролни и чернодробни PTG OE мишки на възраст 6 седмици са хранени със стандартна диета или HFD в продължение на 16 седмици. Нахранени и 16-часови гладни мишки бяха убити. О: Относителна иРНК на PTG в черния дроб при хранени условия. B: Активност на чернодробна GS, изразена като съотношение на (-) Glc-6-P/(+) Glc-6-P при условия на хранене. C: Съдържание на гликоген в черния дроб при хранене или 16-часово бързо. D: Съдържание на гликоген в мускулите на квадрицепсите при хранене. Данните са средни ± SEM. n = 5-8/група. * P OE мишки, хранени със стандартна диета или HFD; ^ P OE мишки и постни PTG OE мишки; §P OE мишки показаха приблизително двукратно увеличение на съдържанието на гликоген в черния дроб в сравнение с контролните животни (фиг. 1С), независимо дали са получили стандартна диета или HFD (фиг. 1С).

След бърза нощ, PTG OE мишките показаха намалено съдържание на чернодробен гликоген в сравнение със състоянието на хранене. Това наблюдение показва нетна мобилизация на гликоген в черния дроб, въпреки че този гликоген не е изчерпан в същата степен, както при контролните мишки (фиг. 1С). Освен това, когато гладуват, контролните мишки, получаващи HFD, показват по-високо съдържание на чернодробен гликоген, отколкото на гладно контролните животни, хранени със стандартната диета, както беше съобщено по-рано (25) (Фиг. 1С). Съдържанието на гликоген в скелетните мускули е сходно между групите и по този начин е в съответствие с идеята, че синтезът на гликоген в нехепаталните тъкани не е променен (Фиг. 1D).

HFD-Fed PTG OE мишките имат по-нисък прием на храна и намалено затлъстяване

Разходите за енергия при контролни и PTG OE животни, хранени със стандартна диета или HFD. Контролни и чернодробни PTG OE мишки на възраст 6 седмици са хранени със стандартна диета или HFD в продължение на 16 седмици. О: Консумацията на кислород в покой по време на светлата и тъмната фаза и общо животни, хранени със стандартна диета. Б: Потреблението на кислород в покой по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени с HFD. C: RER по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени със стандартна диета. D: RER по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени с HFD. Д: Локомоторна активност (амбулация) по време на светлата и тъмната фаза и обща активност на животните, хранени със стандартна диета. F: Локомоторна активност (амбулация) по време на светлата и тъмната фази и обща активност на животни, хранени с HFD. G: Локомоторна активност (общ брой) по време на светлата и тъмната фаза и обща активност на животни, хранени със стандартна диета. H: Локомоторна активност (общ брой) по време на светлата и тъмната фази и обща активност на животни, хранени с HFD. Данните са средни ± SEM. n = 6-8/група. SD, стандартна диета.

RER, окисляване на глюкоза и липиди. Контролни и чернодробни PTG OE мишки на възраст 6 седмици са хранени със стандартна диета или HFD в продължение на 16 седмици. О: RER по време на светлата и тъмната фаза и общо животни, хранени със стандартна диета. B: RER по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени с HFD. В: Окисляване на глюкозата по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени със стандартна диета. D: Окисляване на глюкозата по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени с HFD. Д: Липидно окисление по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени със стандартна диета. F: Липидно окисляване на животни по време на светлата и тъмната фази и общо животни, хранени с HFD. G: Количествена PCR в реално време, показваща относителни нива на иРНК на Ucp1, Ucp2 и Ucp3 в кафявата мастна тъкан на животни, хранени с HFD. H: Основна телесна температура на животни, хранени с HFD. Данните са средни ± SEM. n = 6-8/група. * P OE мишки, хранени със стандартна диета или HFD. НЕТ, кафява мастна тъкан; SD, стандартна диета.

По време на периода на хранене (тъмна фаза), RER е леко увеличен при HFD-хранени PTG OE мишки, като по този начин показва, че тези животни са използвали повече въглехидрати като енергиен източник, отколкото контролната група през нощта (фиг. 4В). Тези резултати бяха потвърдени чрез изчисляване на количеството окислена глюкоза, което беше увеличено при PTG OE мишки, хранени с HFD (фиг. 4D). Въпреки това, PTG OE, хранени със стандартна диета, окисляват същото количество глюкоза като контролните мишки (фиг. 4С). Не е установена промяна в окисляването на липидите при PTG OE мишки, хранени със стандартна диета (фиг. 4Е) или HFD (фиг. 4F). Тъй като окислението на глюкозата е по-високо при PTG OE, хранено с HFD, ние разгледахме съдържанието на чернодробен ATP. Известно е, че този параметър е намален в черния дроб на HFD-индуцирани мишки с диабет (29). Съдържанието на ATP в черния дроб на мишки, хранени с HFD, беше значително намалено, а свръхекспресията на PTG доведе до съдържание на ATP, подобно на това на мишки, хранени със стандартна диета (Фиг. 2Н).

Ефекти на свръхекспресията на чернодробна PTG върху кръвната глюкоза, нивата на инсулина, толерантността към глюкозата и чувствителността към инсулин

Черният дроб играе ключова роля за изчистването на кръвната глюкоза в постпрандиалното състояние (30). Fed PTG OE животните са имали по-ниски нива на глюкоза в кръвта, отколкото контролните кученца, независимо от получената диета (фиг. 5А). Нивата на кръвната глюкоза и плазмената концентрация на инсулин намаляват при контролните животни, когато са лишени от храна в продължение на 16 часа (фиг. 5А и В). Въпреки това, постните PTG OE мишки имат сходни нива на глюкоза и инсулин, както хранените PTG OE мишки. Този ефект се наблюдава независимо от дадената диета (фиг. 5А и Б). Освен това, хранените с HFD PTG OE мишки показват по-ниски нива на инсулин в хранено състояние в сравнение с контролните мишки на същата диета (фиг. 5В).

Също така измерихме секрецията на инсулин по време на интраперитонеалната GTT. В отговор на HFD, PTG OE мишки показаха намаляване на стимулираното от глюкоза освобождаване на инсулин в сравнение с контролните мишки (фиг. 5D). Трябва да се отбележи, че освобождаването на инсулин при предишните животни е подобно на това при PTG OE животни, хранени със стандартна диета (фиг. 5D).

След това се извърши ITT след 6-часов пост. При тези условия PTG OE мишките, хранени с HFD, вече са имали значително по-ниска концентрация на глюкоза в кръвта от контролните мишки, хранени с HFD (14 ± 1,7 срещу 10 ± 0,3 mmol/L), което затруднява анализа на резултатите от ITT сравнете (фиг. 5Е). Въпреки това, когато ITT беше изразена като процент от първоначалните стойности, кривата за животни, хранени с HFD, беше сходна и при двата генотипа (Фиг. 5F). Трябва да се отбележи, че PTG OE мишките, хранени със стандартна диета, показват по-високи нива на глюкоза в кръвта 60 минути след инжектирането на инсулин. Това откритие предполага, че тези животни са имали по-бързо възстановяване от хипогликемията, индуцирана от инсулин, отколкото техните контролни съседи (фиг. 5Е и F).

Чернодробната PTG свръхекспресия намалява индуцирана от HFD чернодробна стеатоза

Също така анализирахме ефекта от свръхекспресията на PTG върху съхранението на чернодробните триацилглицериди. Когато се хранят със стандартна диета, PTG OE мишките представят сходно съдържание на триацилглицерол в черния дроб като техните контролни отпадъци (фиг. 6А и В), което предполага, че PTG не е свързан с липидния метаболизъм при тези обстоятелства. Освен това, експресията на гени, свързани с de novo липогенезата, не са модифицирани при PTG OE животни, хранени със стандартна диета (фиг. 6С). Въпреки това, когато се хранят с HFD, тези животни показват по-ниско съдържание на чернодробни триглицериди (фиг. 6А и В), което е свързано с понижаване на регулацията на експресията на гени SREBP1, GK, PPARγ и MGAT1 (фиг. 6С и D). Както беше описано по-рано (31), потвърдихме, че експресията на PPARy и MGAT1 е много ниска в нормалния черен дроб, но е силно изразена в мастния черен дроб (Фиг. 6D). Няма статистически значими разлики в експресията на липогенни гени, като Pklr, Fasn и Acc1α, между групите, хранени с HFD (Фиг. 6С). Освен това беше оценена експресията на гени, свързани с липидното окисление. Не са открити разлики между генотипите в експресията на PPARα, Cpt1α или Acox1 в черния дроб (Фиг. 6Е).

В допълнение, PTG OE мишките, хранени със стандартна диета, показват подобрен глюкозен толеранс. В съответствие с това схващане, свръхекспресията на PTG, индуцирана от аденовирус при нормални плъхове, доведе до умерено подобряване на глюкозния толеранс; тези животни обаче не успяха да покажат по-ниски нива на гликоген в отговор на гладно (8). В нашия модел на чернодробни PTG OE мишки, животните разграждат гликогена в отговор на гладно, въпреки че не са били в състояние напълно да изчерпят запасите от този полизахарид след 16-часов период на гладуване. По-важното е, че свръхекспресията на PTG обърна HFD-индуцираната глюкозна непоносимост и хиперинсулинемия. Подобни проучвания показват, че експресията - използвайки аденовирус - на други насочени изоформи на субединицата на PP1, като пресечения вариант на мускулна изоформа, наречена „GMΔC“, подобрява непоносимостта към глюкоза при плъхове, хранени с HFD, но не намалява високите нива на инсулин на гладно при тези животни (39).

Настоящите резултати показват, че натрупването на гликоген в черния дроб предотвратява индуцирана от HFD непоносимост към глюкоза, намалява приема на храна и намалява телесното тегло. В заключение резултатите сочат съдържанието на чернодробен гликоген като потенциална цел за фармакологичната манипулация на диабета и затлъстяването.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на Ramon Gomis, Rosa Gasa, Marc Schneeberger и Marc Claret, Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) (Барселона, Испания), за полезни предложения. Те също така благодарят на следните членове на IRB Барселона: Mar García Rocha за помощ и съвет; Мануел Грис, Ема Веза, Наталия Плана и Нуно Васкончелос за техническа помощ; Антонио Беренгер за съвет относно статистическия анализ на данните; и Таня Йейтс за коригиране на английската версия на ръкописа.

Финансиране. Това проучване беше подкрепено от безвъзмездни средства от испанското министерство на икономиката и конкурентоспособността (BFU2011-30554) и CIBERDEM (Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación).

Нито една от подкрепящите агенции няма никаква роля в създаването на произведението или в написването на ръкописа.

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.