Braz J Med Biol Res, ноември 2003 г., том 36 (11) 1589-1594 (кратко съобщение)

диета

Диета, допълнена с левцин, подобри съдържанието на протеин в скелетните мускули при млади плъхове, носещи тумор

M.C.C. Гомес-Маркондес 1, Г. Вентручи 1, М.Т. Толедо 1, Л. Кюри 1 и Дж. К. Купър 2

1 Laboratório de Nutrição e Câncer, Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil
2 Лаборатория за сигнализиране и развитие на лимфоцити, Институтът Бабрахам, Бабрахам, Кеймбридж, Великобритания

Раковата кахексия предизвиква загуба на протеин на гостоприемника, но механизмите са слабо разбрани. Аминокиселините с разклонена верига играят регулаторна роля в модулирането както на синтеза на протеини, така и на разграждането в тъканите на гостоприемника. Левцинът, важна аминокиселина в скелетните мускули, е по-силно окислен при животни, носещи тумор. Използвана диета с добавка на левцин, за да се анализират ефектите от растежа на тумора на Walker 256 върху телесния състав при млади отгледани плъхове Wistar, разделени на две основни диетични групи: нормална диета (N, 18% протеин) и богата на левцин диета (L, 15% протеин плюс 3% левцин), които бяха допълнително подразделени на контролни (N или L) или тумор-носещи (W или LW) подгрупи. След 12 дни животните бяха умъртвени и трупът им беше анализиран. Групите, носещи тумор, показват намаляване на телесното тегло и съдържанието на мазнини. Масата на чист труп беше по-ниска в групите W и LW (W = 19,9 ± 0,6, LW = 23,1 ± 1,0 g срещу N = 29,4 ± 1,3, L = 28,1 ± 1,9 g, P срещу LW = 0,598 ± 0,036, N = 0,623 ± 0,062, L = 0,697 ± 0,065 произволен интензитет, P Ключови думи: левцин, аминокиселина, карциносаркома на Walker 256, състав на тялото, протеин на скелетната мускулатура

Кахексията е слабо разбран синдром, характеризиращ се с анорексия, генерализирана загуба на гостоприемник и разнообразни метаболитни промени, които могат да доведат до смърт (1). Намаляването на чистата телесна маса вероятно се дължи на намаляване на протеиновия синтез и/или увеличаване на катаболизма. Много изследвания показват, че туморът действа като азотен капан, особено за аминокиселините, и се конкурира с гостоприемника за аминокиселини и глюкоза, за да задоволи изискванията му (1-3). Аминокиселините, особено аминокиселините с разклонена верига (BCAA), играят регулаторна роля в модулирането както на протеиновия синтез, така и на разграждането в широк спектър от тъкани. Експериментални данни показват, че основната част от нарастването на синтеза на скелетни мускулни протеини, наблюдавано in vivo след повторно хранене след кратко гладуване, не зависи от промените в анаболните хормони (инсулин), но се дължи на самите аминокиселини (4,5). Louard и сътр. (6) показа, че различните пропорции на диетичен BCAA имат важни благоприятни ефекти върху метаболитните промени, свързани с загуба на мускули.

Ако прогресията на загуба на мускулна маса, наблюдавана при злокачествено неопластично заболяване, може да бъде предотвратена, това би било от клинично значение по отношение на подобряването на прогнозата и качеството на живот на пациентите. Основната цел на настоящото проучване е да се изследват ефектите от растежа на карциносаркома на Walker 256 върху телесния състав на млади плъхове, които са били хранени с нормални (AIN-G93) и диети с високо ниво на левцин (3% левцин, добавен към AIN-G93).

Отбитите мъжки плъхове Wistar (на 25 дни, N = 36, от съоръженията за животни на UNICAMP, CEMIB) са настанени в метаболитни клетки и са държани при нормални условия (22 ± 2ºC и 12/12-часов цикъл светлина/тъмнина) с безплатно достъп до вода и храна за период от 12 дни. Плъховете бяха разделени на четири групи според диетата и имплантирането на тумори: контролна (N) и носеща тумор (W), които бяха хранени с 18% протеинова диета и две други групи, хранени с високо левцинова диета: нетуморни (L) и носещи тумор (LW). Полупречистената контролна диета е AIN-G93 (7), а диетата с висок левцин съдържа 15% протеин, допълнен с 3% левцин. Всяка диета съдържа еквивалентни количества въглехидрати, мазнини и фибри. Тумороносната група се инокулира sc в десния фланг с 0,2 ml (2,5 х 105) жизнеспособни (изключване на трипаново синьо) Walker 256 карциносаркома клетки. На нетуморните плъхове се инжектира sc с 0,2 ml 0,9% (w/v) разтвор на NaCl без анестезия. Общите насоки на UKCCR (1988 г., Координационен комитет на Обединеното кралство за изследване на рака) за хуманно отношение към животните (Етичен комитет за изследване на животните ЦИЕ и COBEA, Бразилия номерирани 0386-1).

Приемът на храна, телесното тегло и теглото на тумора (изчислено от три ортогонални линейни измервания, като се използва кривата на измерението на теглото; 8) се измерват на всеки два дни. След 12 дни животните бяха умъртвени с предозиране на Nembutal, последвано от дислокация на шийката на матката. Проби от мускули на гастрокнемиус се претеглят и хомогенизират в буфер, съдържащ 20 mM Tris HCI, рН 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2 и 1 mM дитиотреитол (разреждане 1: 4). След това целият мускулен хомогенат се центрофугира в продължение на 10 минути при 9000 g, 4 ° С и получената супернатанта се използва за определяне на общото съдържание на протеин. Проби от мускулен протеин (5 µg) бяха разделени върху 12% натриев додецил сулфат полиакриламиден гел, прехвърлени в 0,45 µm нитроцелулозна мембрана (Hybond-C, Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Бъкингамшир, Великобритания) и блокирани с 5% Marvel във фосфатно буфериран физиологичен разтвор, съдържащ 0,1% Tween, рН 7,5, за количествено определяне на тежката верига на миозина, използвайки специфично първично антитяло на тежка верига на миозин, разреждане 1: 250 (Novocastra, Newcastle, UK).

Нитроцелулозните мембрани бяха разработени с помощта на ECL хемилуминесценция (Amersham) и петна, количествено определени с помощта на денситометър. Паралелен гел беше оцветен със сребро, за да се осигури еднакво натоварване. Денситометричните резултати бяха анализирани с помощта на софтуера Gel Pro Analyzer (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). Съдържанието на вода в тялото се изчислява от общата телесна маса минус туморната маса и стомашно-чревния тракт (стомаха до дебелото черво) на всеки труп на плъх чрез сушене и претегляне, докато се постигне постоянно тегло. След това труповете бяха нарязани на парчета за извличане на телесна мазнина. Масата на постния труп се изчислява чрез изваждане на сух труп без мазнина от сух труп, включително мазнина. Определянето на химичния състав на цялото тяло е следвано по методологията на Ventrucci et al. (9). Резултатите се отчитат като средно ± SEM и са анализирани с програмата Graph Pad Prism, v3.00 за Windows 98. Разликите се считат за значими при многократния тест за сравнение на P post hoc Bonferroni (10).

Бяха изследвани ефектите от диетата с висок левцин върху растежа на тумора и телесния състав. Както е показано в Таблица 1, първоначалният прием на храна е сходен сред четирите експериментални групи (P> 0,05), въпреки че в края на експеримента и двете носещи тумор групи (W и LW) демонстрират намаляване на приема на храна в сравнение с не -туморни плъхове (W срещу N, P срещу L, P срещу N и LW срещу L, P срещу L, P срещу W = 96,8 ± 5,1 g, P> 0,05) и тегло на тумора (W = 7,84 ± 1,04 и LW = 7,38 ± 0,62 g). Съдържанието на вода в тялото се увеличава при плъхове, носещи тумор (P срещу N и L, P срещу N, P 0,05) спрямо L групата. Групата LW също показа по-висока чиста маса на трупа в сравнение с групата W (LW срещу W, P срещу N), но групата LW показа само леко намаляване на мускулното тегло (LW = 0,248 ± 0,033 g). Наблюдавана е значителна разлика в сравнение с L и W групите (P in vivo окислението на левцин до CO 2 се засилва при животни, носещи тумор (3,15) и е свързано с увеличаване на оборота на аминокиселини. Argiles et al. ( 16) предполага, че скоростта на мускулна протеолиза в катаболни състояния се модулира от фактори или съединения посредством отрицателна обратна връзка.

В нашата лаборатория се провеждат допълнителни проучвания, за да се определи дали и как добавките с левцин биха могли да противодействат на загубата на труп на гостоприемник по време на ракова кахексия. Бързият неопластичен растеж предизвика вредни промени в гостоприемника поради загуба на труп. Тези ефекти са по-тежки в групата W, отколкото в групата LW. Отслабването на разхищаването на тъканите на гостоприемника, наблюдавано при носещи тумор левцин-допълнени плъхове, предполага, че тази аминокиселина може да действа пряко и непряко върху механизми, водещи до стимулиране на синтеза и/или инхибиране на процеса на окисляване в клетките гостоприемници.

Фигура 1. A, Анализ на съдържанието на тежка верига на миозин в контролния мускул на гастрокнемия (N), плъхове, носещи карциносаркома на Walker 256 (W), контролни плъхове, хранени с диета, допълнена с левцин (L), и плъхове, носещи тумор, получаващи левцин -допълнена диета (LW). Петното е представително за 8 мускулни проби от всяка група. Хомогенизираните фракции от цял ​​гастрокнемиален мускулен протеин (5 ug) се изследват с моноклонално антитяло срещу тежка верига на миозин, както е описано в Методи. B, Денситометричен анализ на съдържанието на тежка верига на миозин в мускулите на гастрокнемия от четири отделни петна (означава ± SEM за 8 животни във всяка група). * Р

1. Tisdale MJ (2002). Кахексия при пациенти с рак. Отзиви за природата. Рак, 2: 862-871. [Връзки]

2. Rivera S, Azcon-Bieto J, Lopez-Soriano FJ, Miralpeix M & Argiles JM (1988). Аминокиселинен метаболизъм при мишки, носещи тумор. Биохимичен вестник, 249: 443-449. [Връзки]

3. Argiles JM & Lopez-Soriano FJ (1990). Окислението на левцин при плъхове, носещи тумор. Биохимичен вестник, 268: 241-244. [Връзки]

4. Vary TC, Jefferson LS & Kimball SR (1999). Индуцирана от аминокиселина стимулация на иницииране на транслация в скелетните мускули на плъхове. Американски вестник по физиология, 277 (6 част 1): E1077-E1086. [Връзки]

5. Yoshizawa F, Kimball SR, Vary TC & Jefferson LS (1998). Ефект на диетичния протеин върху инициирането на транслация в скелетните мускули и черния дроб на плъхове. Американски вестник по физиология, 275 (5 част 1): E814-E820. [Връзки]

6. Louard RJ, Barrett EJ & Gelfand RA (1995). Инфузията на аминокиселини с разклонена верига през нощта води до трайно потискане на мускулната протеолиза. Метаболизъм, 44: 424-429. [Връзки]

7. Reeves PG, Nielsen FH & Fahey Jr GC (1993). Пречистени диети AIN-93 за лабораторни гризачи: окончателен доклад на специалната комисия на Американския институт по хранене относно преформулирането на диетата за гризачи AIN-76A. Journal of Nutrition, 123: 1939-1951. [Връзки]

8. Gomes-Marcondes MCC, Cury L & Curi R (1998). Последици от растежа на тумора Walker 256 за развитието на плацентата/плода при плъхове. Изследване на рака, терапия и контрол, 5: 277-283. [Връзки]

9. Ventrucci G, Mello MA & Gomes-Marcondes MC (2001). Ефект на диета с добавка на левцин върху промените в телесния състав при бременни плъхове, носещи тумор на Walker 256. Бразилски вестник за медицински и биологични изследвания, 34: 333-338. [Връзки]

10. Gad SC & Weil CS (1994). Статистика за токсиколозите. В: Gad SC & Weil CS (Редактори), Принципи и методи на токсикологията. 3-то изд. Уолъс Хейс, Raven Press, Ltd., Ню Йорк, 221-274. [Връзки]

11. Cohn SH, Gartenhaus W, Sawitsky A, Rai K, Zanzi I, Vaswani A, Ellis KJ, Yasumura S, Cortes E & Vartsky D (1981). Отделен телесен състав на пациенти с рак чрез измерване на общия телесен азот, калий и вода. Метаболизъм, 30: 222-229. [Връзки]

12. Gonçalves EL, Waitzberg DL, Bevilacqua RG & Bevilacqua LR (1990). Състав на тялото при различни хранителни условия. Експериментално проучване. Ревиста Паулиста де Медицина, 108: 125-133. [Връзки]

13. Metzger S, Hassin T, Barash V, Pappo O & Chajek-Shaul T (2001). Намалена телесна мазнина и повишен синтез на чернодробни липиди при мишки, носещи тумор, секретиращ интерлевкин-6. Американски вестник по физиология, 281: E957-E965. [Връзки]

14. Ventrucci G, de Mello MA и Gomes-Marcondes MC (2002). Ефекти на диета, допълнена с левцин, върху чревната абсорбция при бременни плъхове, носещи тумор. BioMedical Central Cancer, 2: 7. [http://www.biomedcentral.com/1471-2407/2/7]. [Връзки]

15. Costelli P, Llovera M, Garcia-Martinez C, Carbo N, Lopez-Soriano FJ & Argiles JM (1995). Засилено окисление на левцин при плъхове, носещи асцитен хепатом (Yoshida AH-130) и неговото обръщане от кленбутерол. Ракови букви, 91: 73-78. [Връзки]

16. Argiles JM, Costelli P, Carbo N & Lopez-Soriano FJ (1996). Катаболизъм на аминокиселини с разклонена верига и ракова кахексия. Онкологични доклади, 3: 687-690. [Връзки]

17. Tessitore L, Costelli P & Baccino FM (1993). Хуморално посредничество за кахексия при плъхове, носещи тумор. British Journal of Cancer, 67: 15-23. [Връзки]

18. Hunter DC, Weintraub M, Blackburn GL & Bistrian BR (1989). Аминокиселини с разклонена верига като протеинов компонент на парентералното хранене при ракова кахексия. Британски вестник по хирургия, 76: 149-153. [Връзки]

19. Busquets S, Alvarez B, Llovera M, Agell N, Lopez-Soriano FJ & Argiles JM (2000). Аминокиселините с разклонена верига инхибират протеолизата в скелетните мускули на плъхове: участващи механизми. Списание за клетъчна физиология, 184: 380-384. [Връзки]

20. Anthony JC, Lang CH, Crozier SJ, Anthony TG, MacLean DA, Kimball SR & Jefferson LS (2002). Принос на инсулина към транслационния контрол на протеиновия синтез в скелетните мускули от левцин. Американски вестник по физиология, 282: E1092-E1101. [Връзки]

Благодарности

Авторите са благодарни на д-р Juvenal Marcondes Neto за компютърната помощ и на д-р Maria Alice Rostom de Mello за предложения. Ajinomoto Interamericana Ind. & Com. Ltda., Corn Products Brazil Ingredients и Roche Industria & Química S.A. любезно дариха диетичните съставки.

Кореспонденция и бележки под линия

Адрес за кореспонденция: M.C.C. Gomes-Marcondes, Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, UNICAMP, 13083-970 Campinas, SP, Бразилия. Факс: + 55-19-3788-6185. Имейл: [email protected]

Изследвания, подкрепени от FAPESP (№ 2001/02135-3 и 1996/9463-6), CNPq (№ 521048/95-8) и FAEP-UNICAMP (№ 017/2001 и 0478/2002). Получено на 18 февруари 2003 г. Прието на 15 юли 2003 г.

Цялото съдържание на това списание, с изключение на случаите, когато е отбелязано друго, е лицензирано под лиценз Creative Commons Attribution