От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

От Отдела по ендокринология и метаболизъм (AL, SM, WP, JLW) и Отдел по инфекциозни болести (SPC, MO, JF), Катедра по медицина, Калифорнийски университет, Сан Диего, и VA Healthcare San Diego (JF), La Джола, Калифорния. Първите двама автори допринесоха еднакво за тази работа.

Резюме

Мишките бързо се превръщат в предпочитан модел за изследване на атеросклероза. Повечето мишки от див тип обикновено са устойчиви на хиперхолестеролемия и атерогенеза, дори когато са поставени на диета с високо съдържание на мазнини и висок холестерол. C57BL/6 мишките обаче имат повишена податливост на атеросклероза1 и голям брой трансгенни и генетични модели на нокаут, базирани на този генетичен фон, развиват значителна хиперхолестеролемия и атеросклероза. 2 При тези модели развитието на преходни и напреднали атеросклеротични лезии в аортния произход и в цялата аорта обикновено зависи от продължителното хранене с диети с високо съдържание на мазнини и висок холестерол. Например, LDL-отрицателни (LDLR -/-) мишки, хранени с нормална миша чау, развиват плазмени нива на холестерол от ≈250 mg/dL и ограничена атеросклероза, докато диетите с висок холестерол предизвикват нива на холестерол> 1200 mg/dL и обширна атеросклероза през аортно дърво. 3 4 За разлика от това, аполипопротеиновите (апо) Е-дефицитни (апоЕ -/-) мишки спонтанно развиват значителна хиперхолестеролемия и атеросклероза дори при нормална чау диета. 5 6 Независимо от това, много проучвания на апоЕ -/- мишки използват „западни“ диети с повишено съдържание на холестерол, за да повишат допълнително плазмените нива на холестерола и да ускорят образуването на лезии. 3 7 8 9

Мишките, хранени с високо холестерол, се използват широко за изследване на атерогенни механизми на апопротеини и липопротеини, липопротеинови и потискащи рецептори, ролята на имунната система и ефектите на диабета. 2 Направени са обаче редица наблюдения, които могат да усложнят интерпретацията на резултатите от тези изследвания. Едно такова наблюдение е фактът, че диетите с високо съдържание на мазнини предизвикват не само хиперхолестеролемия, но и инсулинова резистентност при LDLR -/- мишки. 10 В настоящата статия ние съобщаваме за друг потенциално объркващ ефект, свързан с диетите с високо съдържание на мазнини.

Helicobacter pylori инфекцията (и впоследствие гастрит) наскоро беше свързана със сърдечно-съдови заболявания, 11 12 въпреки че връзката е спорна. По време на предварително проучване, опитващо се да разработи миши модел, в който влиянието на Хеликобактер инфекция при атерогенеза може да бъде изследвана, ние забелязахме, че LDLR -/- мишките, хранени с високо съдържание на мазнини, с високо съдържание на холестерол, по-често показват признаци на гастрит, отколкото мишките, хранени със стандартна чау, независимо от Хеликобактер инфекция. Тъй като атеросклерозата има много характеристики на възпалително заболяване, може да се очаква, че всяко хронично възпаление може да доведе до системни ефекти, които могат да ускорят атерогенния процес. Поради това решихме да проверим хипотезата, че гастритът ще ускори развитието на атеросклероза и отчасти бихме могли да обясним част от променливостта в образуването на лезии между отделни животни в много предишни доклади.

Методи

Животни и диети

Проучване 1

Във всеки от 3 отделни експеримента използвахме мишки LDLR -/- от пето поколение (C57BL/6J × 129Sv) от разплодна колония, създадена от животни, първоначално получени от Джаксън Лаборатории (Бар Харбър, Аз). В предварителен експеримент, шестнадесет 3-месечни женски LDLR -/- мишки са били хранени с високомаслена 1,25% холестеролна диета (TD 92121, Harlan Teklad) в продължение на 8 седмици. Осем от мишките са заразени с Helicobacter felis, щам, за който е известно, че заразява и предизвиква гастрит при мишки. 13 Допълнителни 8 неинфектирани женски мишки на същата възраст бяха хранени с нормална чау (Diet Diet 8604, Harlan Teklad). Съставът на диетите е представен в таблица 1. Въпреки че инфекцията е била неуспешна, тъй като се основава на тест за уреазен дъх, хистология и бактериална култура, ние забелязахме, че честотата на стомашно възпаление е висока при неинфектираните животни, хранени с холестерол, в сравнение с нормалните животни, хранени с чау.

Проучване 2

За по-нататъшно изследване на тази непредвидена находка, ние изследвахме група мъжки LDLR -/- мишки, които бяха достъпни от друго текущо проучване. В това проучване 27 животни са били хранени с високомаслена, 1% диета с холестерол (TD 95286, Harlan Teklad) в продължение на 4,5 месеца. Двадесет контроли бяха хранени с нормален чау.

Проучване 3

Освен това проведохме трето проспективно проучване, използвайки двадесет и шест 8- до 9-месечни женски LDLR -/- мишки. От тях 18 са били хранени с високо съдържание на мазнини, 1,25% холестерол и 8 с нормална чау в продължение на 3 месеца. Във всичките 3 проучвания се претеглят мишки и се вземат 100 μL кръвни проби чрез ретро-орбитално кървене на интервали от 4 до 6 седмици. Общите плазмени нива на холестерол и триглицериди се определят чрез автоматизирана ензимна процедура (Boehringer Mannheim Diagnostics). В проучване 1 животните са евтаназирани на възраст от 4 до 5 месеца, в проучване 2 на възраст от 7 до 8 месеца и в проучване 3 на възраст от 11 до 12 месеца.

Проучване 4

За да се определи дали индуцираният от холестерола гастрит е специфичен за LDLR -/- мишки, мишки от див тип C57BL/6 също са били хранени с диети с високо съдържание на мазнини и висок холестерол в контролен експеримент. Десет женски мишки бяха хранени с високомаслена, 1,25% холестеролна диета (TD92121), а 10 мишки бяха хранени с нормална чау в продължение на 3,5 месеца.

За всички тези проучвания мишките бяха настанени в отделни групи, ≤4 до клетка, при 12-часов светлинен цикъл и с достъп до храна и вода ad libitum. Мишките бяха убити и стомасите бяха обработени, както е описано по-долу.

Морфометрично определяне на атеросклероза

Морфометричният анализ на атеросклерозата се извършва, както е описано по-горе. 4 9 Накратко, обезболените мишки бяха убити чрез обезкървяване от долната куха вена. Системната циркулация беше перфузирана с PBS, съдържащ EDTA, през игла в лявата камера, докато отпадъчните води не бяха освободени от кръв и след това фиксирани чрез перфузия с 4% параформалдехид-5% разтвор на захароза за 5 минути. Аортата беше почистена, отворена, закрепена върху черна восъчна повърхност и оцветена със Судан IV, както беше описано по-рано. 9 Относителната площ на аортата, покрита от атеросклеротични лезии, беше измерена чрез компютърно подпомогнат анализ на изображението, както е описано. 4 Атеросклерозата беше определена при 10 мишки, хранени с холестерол от проучване 2 и при всички мишки от проспективното проучване 3.

Оценка на стомашно възпаление

Статистически анализ

ANOVA се използва за сравняване на средните стойности на променливите между диетата с високо съдържание на холестерол и нормалните групи на чау. Ман-Уитни U тестът е използван за анализ на данните в 2-те групи гастрит (гастрит, резултат ≥5 и негастрит, резултат 15 При животни, хранени с холестерол, е открит променлив, но като цяло много по-голям брой възпалителни клетки в стомашната лигавица. Фигура 1В показва пример за стомашно възпаление с обилно натрупване на възпалителни клетки в цялата лигавица и простираща се в субмукозата Микрофотографията представлява стомашна секция, която е категоризирана като 7. Клетъчните инфилтрати се състоят главно от лимфоцити, с някои плазмени клетки и неутрофили. При някои животни дори установен е по-тежък гастрит с откровени улцерации, както е показано на Фигура 1С, оценен като 9.

Степента на стомашно възпаление при отделни животни, изразена като оценка на възпалението, е показана на Фигура 2. Във всяко проучване честотата на гастрит (резултат ≥5) е значително по-висока при животни, хранени с диета с висок холестерол, отколкото при животни, на които е дадена нормална чау. В проучване 1, 37% (3/8) от групата, хранени с холестерол, имат оценка на възпаление ≥5, в сравнение с 0% (0/8) от контролните животни (P 0,1).

Във всички проучвания мишките, хранени с холестерол, наддават значително повече тегло от контролните мишки (Таблица 2). Увеличаването на теглото на LDLR -/- мишките, хранени с холестерол, обикновено е малко по-високо при животни с гастрит, отколкото при животни без гастрит, но разликата не е статистически значима (Таблица 3).

Ефекти на гастрита върху нивата на плазмения холестерол и степента на атеросклероза

Както се очаква, общите нива на холестерол в плазмата при LDLR -/- мишките бяха 6 до 8 пъти по-високи при мишки, хранени с холестерол, отколкото при контролни животни (Таблица 2). Когато се сравняват мишки, хранени с холестерол със или без гастрит, средните плазмени нива на липидите са склонни да бъдат малко по-високи при животни без гастрит, отколкото при животни с гастрит (Таблица 3). Не е установена обаче корелация между оценката на възпалението и нивата на холестерола.

Изглежда, че женски мишки от проучване 3 развиват по-малко атеросклероза в цялата аорта, отколкото мъжки мишки в проучване 2, както е показано в таблица 2. При хранените с холестерол животни средната площ на лезиите е била 8,6% при женските и 14,9% при мъжките. Това е в съгласие с предишни доклади от нашата лаборатория. 3 При старите контролни женски животни площта на лезията варира от 2,5% до 6,3% (средно 4,5%). В проучвания 2 и 3, хранени с холестерол животни с гастрит са имали малко повече атеросклероза, отколкото животни без гастрит, но разликите не са статистически значими (Таблица 3).

За да проверим изрично хипотезата, че възпалението, свързано с гастрит, ще ускори атеросклерозата, ние изследвахме корелацията между степента на образуване на лезии и оценката на стомашното възпаление. Както е показано на Фигура 3, степента на атеросклероза показва слаба корелация с оценката на възпалението, в съответствие с тестваната хипотеза (r= 0,32; P= 0,047, 1-опашен анализ). При поетапния анализ на множествената регресия обаче беше установено, че само нивата на холестерол в пола и плазмата са в значителна корелация със степента на атеросклероза.

Тъй като е възможно да се предположи, че възпалителните процеси, свързани с гастрит, водят до повишено липидно окисление и тъй като това може да модулира титъра на циркулиращите антитела към специфични за окислението епитопи, ние също измерихме свързването на антителата с MDA-LDL, специфичен за окисляването епитоп, открит окисляването на LDL в диетичните групи (Таблица 4). В проучване 2, IgG и IgM антителата срещу MDA-LDL са били значително по-високи при мишки, хранени с холестерол, отколкото при контролите. Проучване 3 дава подобни резултати, въпреки че разликата в свързването на IgM не достига значимост. Аналогично увеличение на IgG и IgM антитела по време на увеличаване на атерогенезата е съобщено по-рано при мишки 16 и в много проучвания при хора с коронарна артериална болест. 17 18 Свързването на IgA антитела е значително повишено при животни, хранени с холестерол от проучване 3, но не и при тези от проучване 2. Когато се сравняват данни между животни със или без гастрит, не са открити значителни разлики (данните не са показани).

Дискусия

Настоящото проучване предоставя първите доказателства, че стандартната диета с високо съдържание на мазнини и висок холестерол, използвана за проучвания за атеросклероза при LDLR -/- мишки, е свързана с висока честота на гастрит при тези животни. Тридесет и пет процента от хранените с холестерол LDLR -/- мишки развиват умерен до тежък гастрит в рамките на ≈3 месеца. Дори онези LDLR -/- мишки, които не са развили явен гастрит, показват повече стомашно възпаление, когато се поставят на диета с високо съдържание на мазнини и висок холестерол (Фигура 2). За разлика от това, храненето на същата диета с високо съдържание на мазнини и висок холестерол на мишки от див тип C57BL/6 не е увеличило честотата на гастрит, което предполага, че хиперхолестеролемията и/или липсата на LDLR играе роля в индуцирания от холестерола гастрит.

В заключение, настоящото проучване демонстрира, че стандартната диета с високо съдържание на мазнини и висок холестерол е свързана с значително увеличаване на гастрита при LDLR -/- мишки и предполага, че това може да представлява усложняващ фактор в много проучвания, използващи този модел.

И двамата автори са допринесли еднакво за това проучване.

съдържание

Фигура 1. H-E оцветяване на надлъжните стомашни участъци на LDLR -/- мишки. A, Показва нормална стомашна стена на младо нормално контролирано животно, хранено с чау. Жлезите са плътно натъпкани и субмукозата е бистра (стрелки). B, Показва умерен гастрит при животно, хранено с високо съдържание на мазнини и високо холестерол. Изобилни възпалителни клетки инфилтрират лигавицата, разширявайки пространството между жлезите (върховете на стрелките) и се простират до субмукозата (стрелките). С, Показва тежък гастрит с язва (върхове на стрелки) при животно, хранено с холестерол. Възпалителните клетки и фиброзата се простират до субмукозата (стрелки). Лента = 25 μm.

Фигура 2. Разпределение на резултатите от стомашно възпаление на LDLR -/- - мишки с високо съдържание на мазнини и високо съдържание на холестерол и/и нормални контролни животни, хранени с чау в 3 проучвания. Баровете представляват средната стойност във всяка група.

Фигура 3. Корелация на степента на атеросклероза и оценката на стомашното възпаление при LDLR -/- мишки с високо съдържание на мазнини и високо съдържание на холестерол (r = 0,32; P

маса 1. Състав на диети с високо съдържание на мазнини, високо съдържание на холестерол и нормален чау

Стойностите са грамове на килограм.

Таблица 2. Относително наддаване на тегло, аортна атеросклероза, плазмени концентрации на липиди и резултати от стомашно възпаление при LDLR -/- Мишки, хранени с високо съдържание на мазнини, високо съдържание на холестерол или нормална чау

ND означава, че не е определено. Данните са средни ± SD.

1 Средно за 10 животни.

2 В края на изследването.

3 P 4 P 5 P

Таблица 3. Относително наддаване на тегло, аортна атеросклероза и плазмени нива на липидите при хранени с холестерол мишки с (резултат ≥5) или без (резултат ≤4) гастрит

Данните са средни ± SD.

1 В края на изследването.

2 Средно за 6 животни.

3 Средно за 4 животни.

Таблица 4. Свързване на автоантитела срещу окислени епитопи в MDA-LDL при животни с високо съдържание на мазнини и високо съдържание на холестерол в сравнение с животни с нормално хранене

Стойностите са средни ± SD, изразени като относителни светлинни единици/msec, както е описано.

1 Едно животно е изключено поради стойности извън границите.

2 IgA антитела, измерени от 15 хранени с холестерол и 7 нормални мишки, хранени с чау.