• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

РЕЗЮМЕ

Идентифицираме нов механизъм, свързващ диетата, чревния микробен метаболизъм и бъбречната функция. Установихме, че диетичната интервенция, базирана на сярна аминокиселина, пост-транслационно модифицира микробния ензим, притъпявайки неговата активност, произвеждаща уремичен токсин, и облекчавайки хроничното бъбречно заболяване (ХБН) в предклиничен модел. Ние също така определяме неизвестна досега роля за пост-транслационната модификация S-сулфхидратация в микробиома на червата. Това проучване предоставя рамка за разбиране как диетата може да настрои функцията на микробиотата чрез протеинова посттранслационна модификация, без да променя състава на микробната общност, за да поддържа здравата физиология на гостоприемника извън червата и по-специално как диетичната модификация може да инхибира активността на триптофаназата за подобряване на прогресията на ХБН.

пост-транслационно

Резюме на едно изречение Открихме, че диетата пост-транслационно модифицира протеома на чревната микробиота, за да модулира бъбречната функция.

Основен текст

Хроничното бъбречно заболяване (ХБН) засяга близо 850 милиона души по света (1). Въпреки че диетичната модификация е крайъгълен камък при лечението на ХБН, механистичните роли на взаимодействията между диета и микробиота в патогенезата и лечението на ХБН са недостатъчно проучени. Докато много проучвания с диетични микробиоми са фокусирани върху ефектите на диетичните фибри, мазнини и въглехидрати (2), по-малко се знае за специфичните ефекти на хранителните протеини и аминокиселини, въпреки че 5-10% от хранителните аминокиселини достигат до дебелото черво, където най-много възниква бактериален метаболизъм в червата (3). При хората увеличаването на хранителните протеини увеличава бактериалната продукция на чревния сероводород (H2S), индол и индоксил сулфат (4, 5). Индол и индоксил сулфат са уремични токсини; и H2S има различни физиологични функции, някои от които са медиирани от пост-транслационната модификация S-сулфхидратация (6, 7). Въпреки че са проведени голям брой проучвания в системи на бозайници, физиологичните роли на H2S в регулирането на чревната бактериална функция в гостоприемника са недостатъчно проучени. Освен това, дали има добросъвестни възможности за подобряване на ХБН чрез манипулиране на взаимодействията между диета и микробиота, остава неясно.

А. Мерки за алфа-разнообразие. Б. Бета-разнообразие, претеглен анализ на UniFrac. ° С. Относително изобилие от бактериална фила. д. Относително изобилие от топ 10 на бактериалните родове. Е. Същият анализ като в д, всяка отметка по оста X представлява клетка, позволяваща наблюдение на ефектите в клетката. n = 19 мишки на диета с нисък Саа и 24 мишки на диета с висок Саа.

Най-горният спектър показва добавянето на +32 Da към C363, йони от червена серия представляват естествения пептид на цистеинов остатък (R-SH), а йони от синята серия представляват модификация на цистеин R-SO2/R-S-SH. Долният спектър представлява добавяне на +64 Da към C363, йони от червената серия представляват естествения цистинов остатък (R-SH), а сините йони представляват окисления S-сулфхидратиран (R-S-SO2) или полисулфхидратиран (R-S-S-S) цистеинов остатък.

Многократно подреждане на последователността (MSA) на 15-те най-близки ортолога на E. coli TnaA при видове чревни бактерии, получени чрез BLAST търсене с E. coli TnaA спрямо базата данни с референтни микробиоми. Идентичните аминокиселини са подчертани в синьо. Горната последователност на логото представлява консенсусната последователност на MSA с цистеиновите остатъци, маркирани в червено. MSA се извършва с помощта на алгоритъма Clustal Omega.

Допълнителни материали и методи Мишки и диетични интервенции

Бактериални щамове и среди

Във всички експерименти бяха използвани щам E. coli K-12 BW25113 (производство на H2S, производство на индол и експерименти in vivo). По технически причини E. coli K-12 MG1655 се използва в процеса на клониране за генериране на ΔdecR и tnaA-his, а E. coli K-12 W3110 се използва за експресиране и пречистване на TnaA-His. Бактериите се отглеждат в LB бульон (Merck) при 37 ° C с разклащане (250 rpm) аеробно или без разклащане анаеробно и където се споменава, LB се допълва с L-цистеин (Sigma-Aldrich), натриев хидросулфид (Sigma-Aldrich) и/или L-триптофан (Sigma-Aldrich). За селекция върху агарни плаки LB + хлорамфеникол (Cm) се използва концентрация от 10 ug/ml Cm. Щамът E. coli tnaA739: kan е получен от Центъра за генетичен запас на университета в Йейл (CGSC) като част от колекцията Keio (29).

Генетични манипулации и клониране на Е. coli

Екстракция на протеини

Сваляне на S-сулфхидратирани протеини

FASP на колона и TMT етикетиране

Метаболитни екстракции за LC-MS/MS анализ на индол и индоксил-сулфат

Масспектрометричен анализ

Изчислителен анализ на данните от мас-спектрометрията

Western blot анализи

Равни обеми на изтеглящи се или пропускащи проби бяха инкубирани при 70 ° С в продължение на 15 минути с буфер за зареждане. Пробите бяха пуснати на 10% сглобяеми протеинови гелове Mini-PROTEAN® TGX ™ (Bio-Rad) с предварително оцветена протеинова стълба Chameleon® Duo (LiCOr) в Tris-Glycine-SDS буфер за работа. След това белтъците бяха прехвърлени в Amersham Protran 0,45 цт нитроцелулозна мембрана в Tris-Glycine трансферен буфер за 1 h при 20 V при стайна температура. Мембраните бяха блокирани като се използва 1: 2 разреждане на Odyssey Blocking PBS буфер (LiCOr) в PBS за 1 h при стайна температура. След това мембраните бяха инкубирани с първични антитела в блокиращ буфер + 0.2% Tween-20 за една нощ. След 5 измивания на PBS + 0,2% Tween-20 (по 5 минути всяка), мембраните се инкубират за 1 h в блокиращ буфер + 0,2% Tween-20 с вторични антитела, конюгирани с флуорофор (LiCOr). Мембраните бяха измити отново 5 пъти с PBS + 0,2% Tween-20 и след това още 2 пъти с PBS, преди да бъдат изобразени на LiCOr Odyssey CLx машина. Изображенията са анализирани и количествено определени с помощта на софтуера ImageJ2 (41).

Колориметрично измерване на индол с помощта на реагент на Kovac

In vitro тестове за триптофаназа

Апо-триптофаназата на Е. coli (Sigma-Aldrich) се ресуспендира в 1 ml 100 mM калиев фосфат рН 8 буфер, аликвотно и се поддържа при -20 ° С. 5 μl апо-триптофаназа бяха добавени към 12 μl 100mM калиев фосфат pH 8 буфер с 1mM пиродксал-5-фосфат (PLP) и различни обработки (NaCl, NaHS, L-цистеин, DTT или Na2S4) и инкубирани за 45 минути при 37 ° C . След това се добавят 12 µl от 100 тМ калиев фосфат с 5 тМ L-триптофан и пробите се инкубират в продължение на 1 час при 37 ° С. След това към пробите се добавят 250 ul 20% TCA, последвано от 15-минутна инкубация върху лед за утаяване на TnaA. Пробите се центрофугират в продължение на 10 минути при максимална скорост, супернатантата се прехвърля в нова епруветка от 1,5 ml и се добавят 500 μl реагент на Kovac, последвано от вихрово и 30-минутно инкубиране при стайна температура, преди да се измери абсорбцията на горния слой при OD530nm.

Измервания на серумен креатинин

Извлича се миши серум, както е споменато по-горе, и нивата на креатинина се измерват с помощта на серумен креатининов колориметричен тест (Cayman Chemical) в дубликати със стандартна крива, следвайки протокола на производителя.

Екстракция на ДНК на цекула и RT-qPCR анализ

Генериране и секвениране на бактериална 16S рДНК ампликон библиотека

Анализ на бактериални 16S рРНК генни ампликонни последователности

Нашият анализ на последователността на 16S рРНК генни ампликони се основава на препоръчания стандартен оперативен протокол от Langille et al (43), използвайки обвивката на микробиома-помощник. Накратко, fastq файлове бяха получени за всяка библиотека със среден брой четения от 73 905 250-bp сдвоени четения и качеството на четенията беше проверено с помощта на FastQC (v0.11.5). Според доклада за качество отчитанията са изрязани с помощта на инструментариума fastx, за да се поддържат само повиквания с висока степен на доверие. Четенията се зашиват с помощта на PEAR (44), конвертират се във формат fasta, а химерните четения се филтрират с помощта на VSEARCH (45). Оперативните таксономични единици (OTU) бяха избрани с помощта на QIIME V1.9 (46) с помощта на програмата sortmerna (47) и OTU с по-малко от 0,1% от четенията бяха изключени като OTU с ниско доверие. И накрая, броят на четенията във всяка библиотека беше разреден до най-ниския размер на библиотеката. Проведени са анализи на α-разнообразие и β-разнообразие (претеглени Unifrac PCOA), като се използва phyloseq R пакет v1.30 (48) на Rstudio v1.25, както и визуализация на таксономични състави. Специфичните OTU разлики между двете диети бяха анализирани с помощта на алгоритмите phyloseq R, LefSe (49) и MaAsLin (50), като се използва клетка като объркваща променлива. За визуализация и анализ на данни се използва и програмата за питони STAMP (51).

Мета-анализ на набори от данни за микробиоми на изпражнения при пациенти с ХБН

Данните за последователността на секвениране на 16S rRNA генни ампликони на проби от изпражнения на пациенти с ХБН (Xu et al., 2017 и непубликувани) бяха изтеглени от NCBI (съответно PRJEB9365 и PRJEB5761). Данните за 16S rRNA генни ампликони се обработват, както е описано по-горе. Метагеномни данни за непубликувани проби от изпражнения на пациент с ХБН са изтеглени от NCBI (присъединяване PRJNA449784) и анализирани от FastQC (v0.11.5), последвано от изрязване на нискокачествени четения и отчитане на тази карта към човешкия геном с помощта на KneadData (v0.7.2). След това филтрираните показания бяха използвани като вход за програмата HUManN2 (v2.8.1) (52), като се получиха 3 матрици от семейства гени, обхват на метаболитните пътища и изобилие на метаболитни пътища, стратифицирани от бактериални видове. За анализа на изобилието на Е. coli се изчислява средният нормализиран на сумата процент на четене на картографиране на гена на Е. coli и пациентите без картографирани четения на Е. coli се отстраняват от анализа и след това се използва преобразуване на квадратни корени за нормализиране на данните. Данните за PhyloChip (12) бяха любезно предоставени от д-р Вазири и анализирани с помощта на R и пакета EnhancedVolcano (v1.4.0).

Измервания на H2S

Хистология

След умъртвяването бъбреците бяха отстранени хирургически от мишки и фиксирани в 4% параформалдехид (PFA), вграден в парафин, разделен на 5 μm и впоследствие оцветен с H&E или трихромни реактиви на Masson. Хистологичният анализ се извършва по заслепен начин от JNG. Анормален паренхим е признат за наличие на едно или повече от следните: тубулно възпаление (тубулит), тубулна дилатация или отпадане, интерстициално възпаление и или фиброза. Беше отбелязана и степента на отлагане на кристали. Количественото оценяване се извършва, както следва: Степента на анормален (възпален) бъбречен паренхим е визуално оценена като процент от общата кортикална площ, в добре ориентирани участъци, които включват както бъбречната кора, така и медулата.

статистически анализи

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на R (v3.4-3.6) на RStudio (v1.25). Списък на използваните пакети е даден в Таблица S5. Ман-Уитни и Крускал-Уолис бяха извършени като статистически тестове по подразбиране, освен ако не е посочено друго в легендите на фигурите.