Допринесе еднакво за тази работа с: Keita Watanabe, Miki Igarashi, Xuan Li

подобрява

Отдел за приложна биологична наука, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Фучу, Токио, Япония

Допринесе еднакво за тази работа с: Keita Watanabe, Miki Igarashi, Xuan Li

Разследване на роли, валидиране, писане - оригинален проект

Отдел за приложна биологична наука, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Фучу, Токио, Япония

Допринесе еднакво за тази работа с: Keita Watanabe, Miki Igarashi, Xuan Li

Роли Куриране на данни, официален анализ, разследване, писане - оригинален проект

Отдел за приложна биологична наука, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Фучу, Токио, Япония

Роли Формален анализ, разследване, методология

Отдел за приложна биологична наука, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Фучу, Токио, Япония

Роли Формален анализ, разследване, писане - оригинален проект

Отдел за приложни биологични науки, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Fuchu, Токио, Япония, AMED-CREST, Японска агенция за медицински изследвания и развитие, Chiyoda-ku, Токио, Япония

Роли Формален анализ, разследване

Отдел за изследователски метаболизъм и хранене, Институт за инициатива за гранична наука, Университет Каназава, Takara-machi, Каназава, Ишикава, Япония

Отдел за приложна биологична наука, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Fuchu, Токио, Япония

Разследване на ролите, методология

Отдел за изследване на здравето и храненето на филиалите, Отдел за научноизследователска и развойна дейност за бъдещо създаване, Fuji Oil Co., Ltd., Tsukuba-mirai, Ibaraki, Япония

Разследване на ролите, методология

Отдел за изследване на здравето и храненето на филиалите, Отдел за научноизследователска и развойна дейност за бъдещо създаване, Fuji Oil Co., Ltd., Tsukuba-mirai, Ibaraki, Япония

Разследване на ролите, методология

Отдел за изследване на здравето и храненето на филиалите, Отдел за научноизследователска и развойна дейност за бъдещо създаване, Fuji Oil Co., Ltd., Tsukuba-mirai, Ibaraki, Япония

Методология на ролите, валидиране

Отдел за изследователски метаболизъм и хранене, Институт за инициатива за гранична наука, Университет Каназава, Takara-machi, Каназава, Ишикава, Япония

Роли Концептуализация, администриране на проекти, надзор, валидиране, писане - оригинален проект

Отдел за приложни биологични науки, Висше училище по земеделие, Токийски университет по земеделие и технологии, Fuchu, Токио, Япония, AMED-CREST, Японска агенция за медицински изследвания и развитие, Chiyoda-ku, Токио, Япония

  • Кейта Уатанабе,
  • Мики Игараши,
  • Сюан Ли,
  • Акихо Накатани,
  • Джунки Миямото,
  • Юка Инаба,
  • Асука Сутоу,
  • Цутому Сайто,
  • Такуми Сато,
  • Нобухико Тачибана

Фигури

Резюме

Цитат: Watanabe K, Igarashi M, Li X, Nakatani A, Miyamoto J, Inaba Y, et al. (2018) Диетичният соев протеин подобрява затлъстяването, предизвикано от диета с високо съдържание на мазнини, като модифицира биотрансформацията на жлъчните киселини в чревната микробиота. PLoS ONE 13 (8): e0202083. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0202083

Редактор: Нобуюки Такахаши, Токийски университет по земеделие, ЯПОНИЯ

Получено: 9 май 2018 г .; Прието: 29 юли 2018 г .; Публикувано: 13 август 2018 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Тази работа беше частично подкрепена от безвъзмездни средства за изследвания от AMED (JP17gm1010007) и JST A-STEP (AS2815103U) към IK. В допълнение, това изследване беше подкрепено от Fuji Oil Co., Ltd. Финансистът осигури подкрепа под формата на заплати за T. Saito, T. Sato и NT и предостави соев протеин, но нямаше никаква допълнителна роля в проучването дизайн, събиране и анализ на данни, решение за публикуване или подготовка на ръкописа. Конкретните роли на тези автори са формулирани в раздела „авторски приноси“.

Конкуриращи се интереси: Всички автори с изключение на трима автори [Т. Saito, T. Sato и NT] нямат конфликт на интереси. T. Saito, T. Sato и NT са служители на Fuji Oil Co., Ltd., която е производител на храни и хранителни добавки, включително SPI.

Въведение

През 2016 г. приблизително 1,9 милиарда възрастни и 340 милиона деца и юноши в цял свят са с наднормено тегло или затлъстяване [1]. Настоящата епидемия от затлъстяване е придружена от повишена честота и разпространение на кардиометаболитни заболявания, като захарен диабет тип II (T2DM) и чернодробна стеатоза и няколко ракови заболявания, които засягат хора от всички възрасти. Смята се, че етиологията на затлъстяването включва сложно взаимодействие между генетичната податливост и демографските фактори и фактори на начина на живот. Промяната в диетата в контекста на промените в начина на живот се разглежда като съществен компонент на стратегиите за превенция и лечение на затлъстяването и свързаните с това състояния.

Соевият протеин се счита за пълноценен протеин, т.е.съдържа повечето незаменими аминокиселини, които се намират в животинските протеини. Хранителната стойност на соевия протеин е приблизително еквивалентна на тази на висококачествения животински протеин. Соевият протеинов изолат (SPI) включва 20% β-конглицинин [16], който има добре документирани благоприятни метаболитни ефекти (например, намалява телесното тегло, телесните мазнини, хипергликемията, инсулиновата резистентност, чернодробната стеатоза и липогенезата) според редица на изследвания върху животни и хора [16–21]. Тези ефекти на соевия протеин са свързани с промени в метаболизма на ВА [13–15], който подлежи на модулация от чревната микробиота [12, 22]; динамичното взаимодействие между тези фактори обаче остава неясно. В настоящото проучване предположихме, че приемът на SPI би имал защитни ефекти срещу наддаване на тегло и затлъстяване в резултат на режим на HFD чрез модулиране на чревната микробиота и сигнализирането на BA. Съответно, ние изследвахме промените в размера и състава на BA басейна и микробиома на цекалите, използвайки HFD-индуциран модел на затлъстяване, за да установим корелацията между приема на соев протеин, чревния микробиом и сигнализирането на BA и да дадем представа за специфичното приложение на соев протеин като диетична интервенция за управление на теглото.

Резултати

Приемът на SPI намалява HFD-индуцираното наддаване на тегло и чернодробната стеатоза и засилена чревна секреция на GLP-1

CONV-R мишките се характеризират с наддаване на телесно тегло (A), прием на храна (B), тегло на епидидимална, периренална, подкожна мастна тъкан и черен дроб и сляпо черво (C), чернодробни триглицериди и хистология на хепатоцити чрез H&E оцветяване (D) ( n = 9-10). Общ холестерол в плазмата (E), плазмен триглицерид (F), плазмен NFFA (G), кръвна глюкоза (H), плазмен инсулин (I), плазмен PYY (J) и плазмен GLP-1 (K) (n = 8– 10). Данните са изразени като средни стойности ± SE. Различията бяха оценени чрез t-тест на Student. Значимостта се установява при коригирано р Фиг. 2. Сравнение между HFD и HFD-SPI-хранени мишки при GF условие.

GF мишките се характеризират с телесно тегло на 12-седмична възраст (A), тегло на епидидимална, периренална, подкожна мастна тъкан и черен дроб и сляпо черво (B) и чернодробен триглицерид (C) (n = 8). Плазмените PYY (D) и GLP-1 (E) бяха измерени чрез ELISA (n = 8). Данните са изразени като средни стойности ± SE. Различията бяха оценени чрез t-тест на Student. Значимостта се установява при коригирани p Фиг. 3. SCFAs и BAs профили при HFD и HFD-SPI-хранени мишки.

Фекалните SCFAs бяха измерени при HFD- и HFD-SPI-хранени CONV-R мишки (A). BAs бяха определени в цекусното съдържание и изпражненията на CONV-R и GF мишки (B и C). Данните бяха показани в абсолютни количества (B, ляво и дясно) и съотношение (B, средна) на първични и вторични BAs и отделни BAs (C). Индивидуални BAs бяха определени в плазмата на CONV-R мишки (D). Данните са изразени като средна стойност ± SE (n = 7-10). Различията бяха оценени чрез t-тест на Student. Значението се установява при коригирано р Фиг. 4. Промени във фекалната микробиота при HFD-SPI-хранени мишки в сравнение с контролите HFD.

(A) Относително изобилие от основни таксономични групи на ниво тип, (B) принцип на координатен анализ (PCoA) и (C) топлинна карта на относителното изобилие от основни таксономични групи на ниво семейство (средно относително изобилие> 0,1%) от фекалната микробиота при мишки, хранени с HFD-SPI, спрямо контролите на HFD, базирани на непретеглени разстояния на Unifrac между диетичните групи. (D) Клостридиев клъстер XIVa на фекалната микробиота беше измерен чрез количествена PCR в реално време. Данните са изразени като средна стойност ± SE (n = 6-8). Различията бяха оценени чрез t-тест на Student. Различията бяха оценени чрез t-тест на Student. Значимостта се установява при коригирани р 2.0 са показани. n = 9 за HFD група, n = 7 за HFD-SPI група.

Дискусия

Лечението с SPI намалява чернодробния триацилглицерол при мишките, хранени с високомаслена диета (фиг. 1D), което вероятно е индуцирано от основния протеин на SPI, β-конглицинин [16]. В предишния доклад, диетичният β-конглицинин проявява превантивни ефекти на затлъстяването на черния дроб или при мишките, хранени с високо съдържание на мазнини, или при плъховете OLETF, което може да бъде причинено от намаляване на PPARγ2, който е един от факторите за чернодробната стеатоза [20, 21, 30]. От друга страна, SPI не е променил плазмените нива на триацилглицерол в това проучване, както и в проучванията, които са използвали β-конглицинин (фиг. 1), което предполага, че основната цел на SPI, както и β-конглицинин, е черният дроб. За разлика от проучванията при животни, клинично проучване предполага, че β-конглицининът намалява серумните нива на триацилглицерол, както и висцералната мастна тъкан при хора [31].

Освен това, нашите резултати предполагат, че устойчивостта на HFD-индуцирано наддаване на тегло, предоставено от SPI, вероятно е следствие от засилената секреция на чревния GLP-1, който има съществени регулаторни роли в ситостта, изпразването на стомаха и глюкозния толеранс чрез насърчаване на β-клетките оцеляване и разпространение. Нашите открития се съгласяват с тези от предишен доклад, посочващ, че увеличеното превръщане на първични BAs във вторични BAs от чревната микробиота насърчава синтеза и секрецията на GLP-1 чрез сигнален път, медииран от TGR5, който демонстрира най-голям афинитет към вторични BAs [ 3, 35]. Следователно е изкушаващо да се спекулира, че приемът на SPI с HFD индуцира промени в илеалната микробиота към конфигурация, която има тенденция да подобрява генерирането на вторични BAs, стимулирайки секрецията на GLP-1 от L-клетки, които са най-богати на илеума и дебелото черво. Въпреки това, диетичният SPI не повлиява нивата на кръвната глюкоза и инсулина, дори увеличава плазмените нива на GLP-1. По-нататъшни експерименти ще бъдат необходими за характеризиране на други физиологични ефекти на SPI.

Взети заедно, резултатите от това проучване демонстрират, че приемът на SPI в HFD упражнява защитни ефекти срещу индуцирано от HFD увеличаване на теглото и натрупване на мазнини в множество тъкани чрез механизъм, който включва модулирана от чревната микробиота модулация на BA сигнализация и GLP-1 секреция при модели на мишки. Някои клинични проучвания демонстрират потенциалните ефекти на соевия протеин и неговия основен компонент, β-конглицинин, върху загубата на тегло, намаляването на серумния триацилглицерол и висцералната мазнина при пациенти със затлъстяване и затлъстяване [18, 31]; въпреки че проучванията не преследват връзката на BAs и микробиома. Както първичните, така и вторичните BA се съобщават като функционални молекули чрез специфични рецептори, съставът на жлъчните киселини, за да предизвика подходящи дейности, все още трябва да бъде изяснен при хората. Следователно е необходимо повишено внимание при екстраполиране на тези резултати към човешкия хранителен режим, като се имат предвид съществените разлики в групата на BA между видовете.

Материали и методи

Мишки, диета и експериментален дизайн

Плазмени биохимични анализи

Кръвната глюкоза се оценява с помощта на преносим глюкомер със съвместими ленти за глюкоза (OneTouch ® Ultra ®, LifeScan, Milpitas, CA). Плазмен холестерол (LabAssay ™ холестерол, Wako, Токио, Япония), NEFA (LabAssay ™ NEFA, Wako), инсулин [Insulin ELISA KIT (RTU), Shibayagi], PYY (Mouse/Rat PYY ELISA Kit, Wako) и триглицериди (LabAssay ™ Нивата на триглицеридите, Wako) бяха измерени с помощта на търговски комплекти за анализ, следвайки инструкциите на производителя. Плазмените нива на GLP-1 се определят чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) (GLP-1 (Active) ELISA KIT, Shibayagi, Gunma, Япония) след лечение с инхибитор на дипептидил пептидаза IV (DPP-IV) (Merck Millipore, Darmstadt, Германия), което предотвратява разграждането на активния GLP-1.

Чернодробна хистология

Черният дроб е вграден в OCT съединения (SAKURA Finetek Япония) и е разделен на 7 μm. Всички резени бяха оцветени с хематоксилин и еозин (HE) за микроскопско изследване.

Количествено определяне на съдържанието на триацилглицерол в черния дроб

Чернодробното съдържание на триацилглицерол се измерва съгласно процедурата, описана по-горе [23]. Накратко, чернодробните хомогенати бяха подложени на сурова липидна екстракция, използвайки смес от хлороформ/метанол/0,5 М оцетна киселина. Органичните фази бяха изсушени и пробата беше възстановена в 2-пропанол като проби за анализ. Нивата на триациклиглицерол се определят в пробните проби с комплект триглицериди LabAssay ™.

Количествено определяне на късоверижните мастни киселини

За измерване на SCFAs, SCFAs в изпражненията бяха определени съгласно модифициран протокол, както е описано по-горе [25].

Количествено определяне на жлъчните киселини

Холева киселина (CA), гликохолева киселина (GCA), тауро-холева киселина (TCA), тауро-хенодезокси холева киселина (TCDCA), α-мурихолова киселина (αMCA), β-мурихолова киселина (βMCA), Tauro-α -мурихолова киселина (TαMCA), тауро-β-мурихолова киселина (TβMCA), дезоксихолова киселина (DCA), тауро-дезоксихолова киселина (TDCA), таурохиодеоксихолова киселина (THDCA), тауро-урсодезоксихолова киселина (TUDCA), литохолова киселина (LCA) и тауро-литохолова киселина (TLCA) са закупени от Rikaken (Токио, Япония).

Плазмата (100 μL) се разрежда с ултрачиста вода (100 μL, Milli-Q [MQ] референтна ултрачиста система за пречистване на вода; Merck Millipore, Дармщат, Германия), алкализира с 0,4 M NaOH (aq) (200 μL) и избистря се чрез центрофугиране (20 000 g, 15 минути, 4 ° С). Избистрената плазма се зарежда върху плака за елуиране на Oasis HLB (Waters), която е била кондиционирана и уравновесена с метанол (200 μL) и ултрачиста вода (400 μL), измита с ултрачиста вода (100 μL) и елуирана с метанол -ацетонитрил (1: 1, v/v, 100 μL) върху вакуумен колектор за екстракционна плоча (Waters).

Лиофилизираните изпражнения и съдържанието на цекали (приблизително 10 mg) се смилат фино и се смесват добре с 0,2 М NaOH (aq) (1 ml). След това смесите се пречистват от липиди, като се използва течно-течна екстракция с хексан (1 ml). Етапът на екстракция се повтаря три пъти и водните фази заедно с твърдите вещества се комбинират и инкубират при 80 ° С в продължение на 20 минути. След охлаждане до стайна температура пробите се центрофугират (20 000 g, 15 минути, 4 ° C) и супернатантите се почистват допълнително с 1 cc патрони на Oasis PRiME HLB (Waters), които са били кондиционирани с метанол (1 ml), последвано от ултра чиста вода (3 ml). Заредените патрони се измиват с ултрачиста вода (500 μL) и аналитите се елуират с метанол-ацетонитрил (1: 1, v/v, 1 mL) за LC-MS анализ.

BA се анализират на система Acquity UPLC, свързана с Waters Xevo TQD MS (Waters, Milford, MA, USA). Разделянето беше постигнато с използване на колона Acquity HSS C18 (2.1 3 100 mm, 1.7 mm) (Waters) и градиентно елуиране с 1% воден разтвор на оцетна киселина и ацетонитрил-изопропанол (9: 1, v/v) като подвижни фази. Аналитите бяха открити чрез мониторинг на множество реакции (MRM) в режим на електроспрей с отрицателни йони с температура на източника и температура на разтваряне, зададени съответно на 150 и 600 ° C. Параметрите на метода MRM бяха определени с помощта на IntelliStart ™ (Waters). Количествените показатели са анализирани с помощта на външни стандарти. Калибраторите бяха приготвени в метанол-ацетонитрил (1: 1, v/v) в диапазона от 0,001–1,0 μg/mL, с контрол на качеството при 0,1 и 1,0 μg/mL.

Анализ на фекална микробиота чрез секвениране на ген 16S рРНК

За откриване на Clostridium клъстер XIVa, Blautia coccoides JCM1395T са предоставени от Японската колекция от микроорганизми на RIKEN BRC и са използвани като стандарти, специално за определяне на ДНК на базата на фекален брой бактерии. Бактериалната ДНК беше изолирана с помощта на MonoFas Bacterial Genomic Kit IV (GLC science, Токио, Япония), следвайки инструкциите на производителя. Количественият PCR анализ в реално време е извършен с използване на SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa, Shiga, Япония) и PCR система в реално време StepOnePlus ™ (Applied Biosystems, Foster City, CA). Последователностите на бактериалните праймери са както следва; Клъстер на клостридий XIVa, 5’-GGAGYATGTGGTTTAATTCGAAGCA-3 ’(напред) и 5’-AGCTGACGACAACCATGCAC-3’ (обратно) [36].