Равиндер Нагпал

1 Катедра по вътрешни болести-Молекулярна медицина и Катедра по микробиология и имунология, Медицинско училище Уейк Форест, Уинстън-Салем, Северна Каролина, САЩ

Тифани М. Нюман

1 Катедра по вътрешни болести-Молекулярна медицина и Катедра по микробиология и имунология, Медицинско училище Уейк Форест, Уинстън-Салем, Северна Каролина, САЩ

Шаохуа Уанг

1 Катедра по вътрешни болести-Молекулярна медицина и Катедра по микробиология и имунология, Медицинско училище Уейк Форест, Уинстън-Салем, Северна Каролина, САЩ

Shalini Jain

1 Катедра по вътрешни болести-Молекулярна медицина и Катедра по микробиология и имунология, Медицинско училище Уейк Форест, Уинстън-Салем, Северна Каролина, САЩ

Джеймс Ф. Ловато

2 Отдел за науките за общественото здраве, Медицинско училище Уейк Форест, Уинстън-Салем, Северна Каролина, САЩ

Хариом Ядав

1 Катедра по вътрешни болести-Молекулярна медицина и Катедра по микробиология и имунология, Медицинско училище Уейк Форест, Уинстън-Салем, Северна Каролина, САЩ

Свързани данни

Всички данни, създадени и използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са включени в статията и допълнителния информационен файл (и). Въпреки това, всички допълнителни данни в подкрепа на констатациите от това проучване са достъпни от съответния автор при поискване.

Резюме

1. Въведение

2. Материали и методи

2.1. Мишки

Около 8 седмици на възраст с недостиг на лептин (Lep ob/ob) и C57BL/6J мъже (n = 12 във всяка група) бяха снабдени от лабораторията Jackson (Bar Harbor, ME, САЩ) и настанени в температура, влажност и контролирано от светлина (12 часа цикъл светлина-тъмнина) Съоръжение за програма за животински ресурси на Wake Forest (ARP) за още 8 седмици. И двете групи мишки бяха хранени с идентична диета (Prolab® RMH 3000 5P00 ∗ от Lab Diets Inc., Сейнт Луис, MO), ad libitum. Фекални проби и мерки за телесно тегло се събират ежеседмично. След 16 седмици се изчисляват тестовете за кръвна глюкоза, глюкоза и инсулин, както и площта под кривата, както е описано в по-ранните ни публикации [6-8]. След това n = 3 животни от всяка група бяха евтаназирани с помощта на CO2 камера и цялото тънко черво (от дванадесетопръстника до илеума) е използвано за органоидни образувания. Останалите животни са използвани за измерване на чревната пропускливост, чревна хистология и анализи на генната експресия. Всички експерименти и процедури с животни са одобрени от IACUC на Wake Forest ARP.

2.2. Образуване и култура на чревни органоиди

Цялото тънко черво на всяка мишка се почиства чрез промиване с PBS и се разрязва по дължина, измива се, прехвърля се в чист PBS и се нарязва на 2 mm сегменти. Чревните сегменти се пипетират напред-назад и се оставят да се утаят. Измиванията се повтаряха

2.3. Анализ на пропускливостта на червата

Половината от животните бяха използвани за измерване на пропускливостта на червата, като същевременно бяха лишени от достъп до храна в продължение на 4 часа и след това се дава перорално 4 kDa FITC-декстран (Sigma; 60 mg/100 g телесно тегло). След 4 часа поглъщане се събира кръв от вената на опашката и серумът се отделя чрез центрофугиране на кръвта. Интензитетът на флуоресценция за FITC в плазмата беше измерен, за да се определи степента на изтичане на червата на FITC-декстран [9].

2.4. PCR в реално време

Експресията на гени, свързани с клетъчна смърт (Bad и Bax), клетъчно оцеляване/пролиферация (т.е. Bcl2, Ccnd1, Cdk6 и Sox4), чревни стволови клетки (Lgr5, Olfm4 и Bmi1) [10], биология на муцина (Muc2 и Muc6) и тесни връзки (оклудин, зонулин-1 и Jam) бяха анализирани с помощта на PCR в реално време (Таблица S1). Общата РНК беше изолирана с помощта на RNeasy kit (Qiagen Inc., САЩ) и обратна транскрипция с помощта на комплект за обратна транскрипция с голям капацитет (Applied Biosystems), допълнително използване на cDNA за PCR в реално време, както е описано в нашите по-ранни проучвания. 18S rRNA се използва като вътрешен контрол. Относителната експресия на гена беше изчислена, използвайки ΔΔCT процедура и представена като относителна промяна в пъти.

2.5. Анализ на Western Blot

Чревната тъкан (илеум) се хомогенизира в хомогенизационен буфер [6, 8] и се извършват Western blot анализи за измерване на протеините с плътно свързване (напр. Zo1 и оклудин). Тубулинът е използван като вътрешен контрол на натоварването. Интензитетите на лентите бяха изчислени с помощта на софтуера ImageJ и представени като промяна на сгъването, като същевременно бяха нормализирани със съдържание на тубулин, заредено във всяка ямка.

2.6. Хистохимичен анализ

За хистологични анализи чревните тъкани от мишки се събират и промиват с PBS, последвано от 10% разтвор на формалин. След това чревните тъкани се потапят в 10% формалин за една нощ и се фиксират върху парафинови блокове и срезове, нарязани с дебелина 0,5 μm. Оцветяването с хематоксилин и еозин (H&E) се извършва по стандартни методи и се правят снимки с помощта на микроскоп AmScope при 20-кратно увеличение с помощта на 9MP цифрова камера. Дължината на вилите и дебелината на чревната стена са измерени с помощта на ImageJ софтуер от заслепен човек.

2.7. Анализ на чревния микробиом

Фекалиите за микробиомен анализ веднага се поставят в стерилни епруветки при асептични условия, замразяват се и се съхраняват при -80 ° C до по-нататъшна обработка. ДНК от проби беше извлечена с помощта на Qiagen DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Калифорния, САЩ) и 16S rRNA генът беше амплифициран с помощта на праймери 515F (баркодирани) и 806R, които фланкираха V4 хипервариабилната област на бактериални 16S rRNAs, следвайки Протокол за проект за земни микробиоми [11–13]. След PCR реакция ампликоните бяха пречистени с помощта на Agencourt® AMPure® XP (Beckman Coulter), количествено измервани с помощта на флуориметър Qubit 3 (Invitrogen), нормализирани до еднаква концентрация (4 nm) и обединени заедно за секвениране на платформа Illumina MiSeq [12].

Генните ампликони на 16S rRNA бяха демултиплексирани, филтрирани по качество и групирани, използвайки параметри по подразбиране в Quantitative Insights Into Microbial Ecology (QIIME версия 1.8.0), софтуер, който позволява анализ на микробната общност [11]. Последователностите бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU) при сходство на последователността от 97% и назначени на OTU чрез софтуера за бране на отворени референции UCLUST в QIIME. Анализ на таксономията и анализи на разнообразие, включително наблюдаваните OTU и индексите на разнообразието на цялото дърво на Шанън, Chao1 и PD, бяха изчислени чрез QIIME с настройки по подразбиране за сравняване на богатството на бактериални видове между двете групи. Бактериалният състав на всяка проба се измерва на различни таксономични нива (тип през род), използвайки QIIME. Алфа и бета различията бяха генерирани в рамките на QIIME чрез използване на претеглени и непретеглени UniFrac матрици за разстояние. Разстоянията на UniFrac се оценяват като разстоянието между бактериалните съобщества, обясняващо филогенетичната връзка между бактериите [14].

2.8. Статистически анализ

Всички стойности, представени тук, са средни ± стандартна грешка на средните стойности. Проведени са студентски t-тест и post hoc ANOVA анализи, за да се установи статистическа значимост. p стойности с ob/ob мишки, свързани с намалена плътна връзка и експресия на муцин ген

Значително увеличение на чревната пропускливост (показана от повишена дифузия на 4KDa FITC-декстран в кръвта от червата) е наблюдавано при мишки Lep ob/ob в сравнение с контрола B6 (Фигура 1 (а)). Експресията на протеини с плътно свързване като (mRNA и протеин) оклудин, зонулин-1 (Zo1) и съединителна адхезионна молекула (Jam), както и mRNAs на ген за синтез на муцин (Muc2 и Muc6), значително намалява в Lep ob/ob мишки (Фигури 1 (b) - 1 (d)), което предполага, че затлъстяването в резултат на недостиг на лептин намалява експресията на стегнати връзки и гени за синтез на муцин, което може да доведе до пропускане на червата с повишена пропускливост.

чревна

Недиетираното затлъстяване развива стабилни промени в клетките, за да образуват анормални чревни структури и повлиява чревната клетъчна хомеостаза. (а – в) Чревни органоиди (а) и техният потенциал за пъпкуване (б, в) намаляват при органоидите, произведени от Lep ob/ob спрямо мишките B6. (d – i) експресия на иРНК на клетъчна смърт (Bad, Bax и Bcl2), клетъчна пролиферация (Ccnd1, Cdk6 и Sox4) и специфични гени на стволови клетки (Lgr5-, Olfm4- и Bmi1-) при затлъстели и В6 черва. Стойностите, представени тук, са средни ± SEM/SD. p стойностите са дефинирани като ∗ ∗∗ ∗∗∗ ob/ob Черва

За да се определи допълнително въздействието на затлъстяването върху чревната клетъчна хомеостаза, която поддържа тъканната структура и цялост, измерихме експресията на клетъчна смърт/оцеляване, пролиферация и гени на стволови клетки в органоидите и чревната тъкан. Установихме, че експресията както на клетъчната смърт (Bad и Bax), така и на клетъчната пролиферация (Ccnd1, Cdk6 и Sox4) е значително увеличена в органоидите и червата на мишките Lep ob/ob в сравнение с нормалните (Фигури 2 (d), 2 (e), 2 (g) и 2 (h)). Експресията на гена за клетъчно оцеляване (Bcl2) е значително намалена при затлъстяване (Фигури 2 (d) и 2 (g)). В допълнение, маркерите на стволовите клетки като експресия на богат на левцин повторносъдържащ G-протеин, свързан рецептор 5 (Lgr5), олфактомедин 4 (Olfm4) и BMI1 (протоонкоген, поликомбен пръстен) се увеличават и в Lep ob/ob червата. като техните органоиди (Фигури 2 (f) и 2 (i)), което предполага, че експозицията на чревни микробиоми на дисбиоза, свързана със затлъстяването, е свързана с по-бърз/необичаен клетъчен обмен на чревни клетки, заедно с повишено стъбло.

3.4. Дисбиозата на чревния микробиом и метаболитните отклонения са свързани при Lep ob/ob мишки, които не зависят от диетичните разлики

Lep ob/ob мишки проявяват значителна чревна микробиомна дисбиоза в сравнение с мишки C57BL/6J (B6), хранени с идентична диета. (а) PCoA анализът показва диференциално групиране на микробиоменния подпис при Lep ob/ob и B6 мишки. (b, c) Изобилие на микробен тип и съотношение Firmicutes: Bacteroidetes (F: B) ​​при мишки Lep ob/ob и B6. (d – f) Значително различаващи се микробни семейства (d) и родове (e), както и гъвкава промяна (процент) между Lep ob/ob и мишки B6. Стойностите, представени тук, са средни ± SEM/SD.

3.5. Дисбиозата на затлъстелите чревни микробиоми е свързана с чревната клетъчна хомеостаза, регулираща чревната пропускливост и биологията на муцина

Връзка на метаболитните функции, чревната морфология и функциите с чревна микробиомна дисбиоза, независимо от диетичните разлики. Корелационен анализ на Spearman за установяване на връзката между метаболитните мерки (телесно тегло, кръвна глюкоза, AUC-GTT и AUC-ITT), промени в пропускливостта на червата, структурни промени в червата и промени в генната експресия и микробиомен подпис на червата между Lep ob/ob и В6 мишки. Представените тук стойности са средно 3–8 повторения. p стойностите се дефинират като * * * ob/ob мишки в сравнение с конвенционалните нормални мишки. Интересното е, че мишките със затлъстяване показват значително повишено изобилие от бактерии Lachnospiraceae, за които е известно, че повишават неиндуцираната от диета инсулинова резистентност/диабет тип 2 при затлъстели мишки [17]. Въпреки че изобилието на Akkermansia е повлияло значително при пациенти, лекувани с метформин (антидиабетна медицина), както и е известно, че е намалено при индуцирано от HFD затлъстяване [18, 19], нашите проучвания показват, че изобилието на тази група бактерии се увеличава в Lep ob/ob мишки, което предполага, че изчерпването на Akkermansia при затлъстели хора може да е свързано с прием на високо съдържание на мазнини.

Тук обаче все още не знаем кой е допринесъл предимно за такива промени, затлъстяване или дисбиоза на чревния микробиом и такива причинно-следствени ефекти налагат допълнително проучване. Такива ефекти обаче са ясно независими от разликите в хранителните съставки. Следователно има много неща, които трябва да открием, за да изясним връзката между затлъстяването, микробиотата и пропускливостта на червата, което може да допринесе за ненормална функция на червата и клетъчна хомеостаза.

5. Заключения

Приносът на чревния микробиом в патофизиологията на затлъстяването е известен; обаче неговият (ите) механизъм (и) на действие не е (са) добре дефиниран (и). Нашето проучване установи тясна връзка между свързаната със затлъстяването чревна микробиомна дисбиоза, за да предизвика нарушения в хомеостазата на чревния клетъчен оборот и функциите за регулиране на пропускливостта на червата, независимо от хранителните съставки като високо съдържание на мазнини. Въпреки че нашите изследвания все още имат ограничения, за да обяснят причинно-следствената връзка за промените в клетъчния оборот, предизвикани от микробиомна дисбиоза или обратно, нашите резултати силно подкрепят основата за изследване на ролята на взаимодействията между хранителни вещества и микробиоми и гени за модулиране на физиологията на червата при патология на затлъстяването.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от средствата на Медицинското училище „Уейк Форест“ и Центъра по диабет, затлъстяване и метаболизъм и финансирането от Министерството на отбраната (PR170446). В допълнение, авторите биха искали да признаят подкрепата за финансиране, биостатистиката и услугите за редактиране на английски език на Института за клинична и транслационна наука Wake Forest (WF CTSI), който се поддържа от Националния център за развитие на транслационните науки (NCATS), Национален Институти по здравеопазване чрез номер на безвъзмездна финансова помощ UL1TR001420.

Наличност на данни

Всички данни, създадени и използвани в подкрепа на констатациите от това проучване, са включени в статията и допълнителния информационен файл (и). Въпреки това, всички допълнителни данни в подкрепа на констатациите от това проучване са достъпни от съответния автор при поискване.

Конфликт на интереси

За тази творба не се декларира конфликт на интереси.