Резюме

Ние се стремим да определим: 1) дали дългосрочната диета с високо съдържание на сол предизвиква хипертония и бъбречно увреждане при плъхове Sprague-Dawley (SD) и 2) дали индуцираната от диета хипертония с високо съдържание на сол и бъбречното увреждане са свързани с намалена бъбречна експресия на VEGF. Дванадесет мъжки SD плъхове на възраст 10 седмици са получавали диета с високо съдържание на сол (HS, 8%), а дванадесет SD плъхове са получавали нормална солена диета (NS, 0.5%) в продължение на 8 седмици. Използвайки маншет за опашка, ежеседмичното наблюдение показва, че кръвното налягане се е увеличило значително след 6, 7 и 8 седмици в HS група, в сравнение с NS група (P Ключови думи: дългосрочна диета с високо съдържание на сол, плъх Sprague-Dawley, хипертония, бъбречен VEGF

Въведение

Въз основа на всички констатации, споменати по-горе, предполагаме, че дългосрочната диета с високо съдържание на сол може да причини бъбречно увреждане и хипертония, които са свързани с намалена бъбречна експресия на VEGF при нормотензивни гризачи като плъхове Sprague-Dawley. В настоящото проучване ние се стремим да определим: 1) дали дългосрочната диета с високо съдържание на сол (8 седмици) предизвиква хипертония и бъбречно увреждане при плъхове Sprague-Dawley (SD) и 2) дали хипертонията и бъбреците, предизвикани от диета с високо съдържание на сол нараняванията са свързани с намалена бъбречна експресия на VEGF.

Методи

Протокол за животни

Измервания на кръвното налягане

По време на 8-седмичния експериментален период систолното кръвно налягане се измерва ежеседмично при плъховете NS и HS SD (n = 12 всяка група) чрез плетизмография на опашката (IITV, Inc). След 4 седмици или 8 седмици от експеримента, и двете групи SD плъхове (n = 6 всяка група) се анестезират чрез вдишване на изофлуран с помощта на газов изпарител (Harvard Appair, Holliston, MA). С помощта на асептични техники, микрокатетър се поставя в сънната артерия и се насочва под кожата към задната част на врата и се закрепва. Два дни след като плъховете се възстановиха от операцията, катетърът беше свързан към компютъризирана система за наблюдение, наречена PowerLab (AD Instruments, Castle Hill, Австралия), за да записва непрекъснато MAP и сърдечната честота (HR) в съзнателните SD плъхове 4 часа/ден за 2 дни. Измерванията на MAP и HR при всеки плъх се извършват едновременно и всички стойности за всеки плъх представляват средната стойност от 4 часа/ден за 2-дневни измервания.

Анализ на Северно петно

Обща РНК се приготвя от бъбреците на SD плъхове (n = 6 всяка група) след 8 седмици нормална сол или диета с високо съдържание на сол, като се използва модифициран метод на базата на гуанидиний (комплект за изолация на тотална РНК, Ambion, Austin, TX), както е описано по-горе (34). Геномната ДНК се отстранява чрез третиране с ДНКаза I без RNase, последвано от екстракция с фенол/хлороформ и утаяване с етанол. Целостта на РНК е проверена на MOPS-формалдехиден агарозен гел преди синтеза на cDNA. Експресията на VEGF иРНК в бъбреците беше изследвана чрез Northern blotting, както беше описано по-рано (34). Сондата VEGF cDNA е 580-bp EcoR I-BamHI фрагмент от мишата VEGF cDNA, който е клониран в pBluescrip плазмид. CDNA сондата е белязана с α- 32 P-dCTP (New England Nuclear, Бостън, Масачузетс), като се използва Multiprime произволно грундиран ДНК етикетиращ комплект (Amersham, UK). Квантуването на експресията на VEGF иРНК беше извършено върху фосфорни изображения на петна, които бяха събрани с помощта на Phosphor-Imager (Molecular Dynamics; софтуер: ImageQuant 3.3, Molecular Dynamics). За да се провери относителното количество на общата РНК, филтрите се хибридизират с 32 Р-маркирана 28S рРНК антисенс олигонуклеотидна сонда (Ambion). Експресията на VEGF иРНК се нормализира спрямо 28S рРНК във всяка проба.

Измервания на нивата на протеин на VEGF и sFlt-1 чрез ELISA

Нивата на протеини на VEGF и sFlt-1 в плазмата, урината и цялата бъбречна тъкан на SD плъхове бяха определени с помощта на миши VEGF и миши sFlt-1 ELISA комплекти (R&D Systems, Minneapolis, MN), съгласно инструкциите на производителя. Тъканни проби от цели бъбреци се хомогенизират в ледено студен PBS буфер, съдържащ протеазен инхибиторен коктейл и общите протеини се екстрахират с помощта на NE-PER цитоплазматични екстракционни реактиви (Pierce, Rockford, IL), съгласно протокола на производителя. Тези екстракционни реагенти не повлияват измерванията на тъканните протеини на тези цитокини в сравнение с други редовни методи за екстракция на протеини. Общата концентрация на протеин в тъканната супернатанта беше определена с помощта на Bio-Rad протеинов анализ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Нивата на протеин на VEGF в цялата бъбречна тъкан са нормализирани и изразени като пикограми на милиграм общ тъкан протеин.

Хистологичен анализ чрез светлинна микроскопия

Средно-короналните участъци на левите бъбреци, събрани както от нормално захранени със сол, така и от групи, хранени с висока сол, бяха фиксирани в буфериран формалин и вградени в парафин за хистологични изследвания, както е описано по-рано (20, 35). Пробите се нарязват на 3 µm срезове и се оцветяват с периодичен киселинно-шифов реагент (PAS), последван от хематоксилиново противооцветяване. Всички секции бяха анализирани чрез полуколичествено хистологично класиране (0 = отсъства, 1+ = леко, 2+ = умерено и 3+ = тежко) за тежестта на тубулоинтерстициалната инфилтрация с възпалителни клетки, фокална сегментарна гломерулосклероза, тубулоинтерстициално увреждане и разширение на извънклетъчния матрикс . Средната гломерулна площ в оцветените с PAS участъци беше определена от 30 до 40 гломерули във всеки бъбрек на екрана на компютъра с помощта на софтуера Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Inc., Silver Spring, MD).

Статистически анализи

Всички определяния бяха извършени в дублирани набори. Когато е посочено, данните се представят като средно ± SE. Статистически значимите разлики в средните стойности между две групи бяха тествани чрез несдвоен t-тест на Student. ANOVA беше използван за анализ на разликите между две групи с множество сравнения. Стойност на P Фигура 1 A. показва, че чрез ежеседмично проследяване на кръвното налягане с помощта на маншет за опашка, няма значителна разлика в систоличното кръвно налягане през 1 до 5 седмици между NS и HS групите на SD плъхове, но систолното кръвно налягане значително се увеличава след 6, 7 и 8 седмици в HS група, в сравнение с NS група (P Фигура 1В показва, че 4 седмици диета с високо съдържание на сол (8%) не променя значително MAP при SD плъхове в сравнение с SD плъхове с нормална солена диета (123 ± 6,1 срещу 118 ± 2,7 mmHg; n = 6; P> 0,05); обаче, след 8 седмици от диетичната програма, MAP е значително по-висок при HS от групата с NS (140 ± 5,3 срещу 112 ± 2,2 mmHg; n = 6; P 0,05). Няма значителна разлика в телесното тегло между групите HS и HS (370,0 ± 8,9 срещу 359,3 ± 8,0 g; n = 6; P = 0,41).

хипертония