• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • Запис на ORCID за Fredrik Höök
  • За кореспонденция: pernilla.wittung @ chalmers.sefredrik.hook @ chalmers.se

Редактирано от Уилям Ф. ДеГрадо, Калифорнийски университет, Сан Франциско, Калифорния, и одобрено на 7 май 2020 г. (получено за преглед на 22 август 2019 г.)

изобразяване

Значимост

Невродегенеративните заболявания се увеличават сред световното население, но няма лечение. Всички тези нарушения включват протеини, които се събират в амилоидни влакна, което води до смърт на мозъчните клетки. Данните сочат, че свързването на тези протеини с липидните мембрани е от решаващо значение както за функционалната, така и за патологичната роля. Смята се, че при болестта на Паркинсон участващият протеин, а-синуклеин, функционира при трафика на липидни везикули в мозъка. В търсене на механистичен произход все по-голям фокус се поставя върху идентифицирането на невротоксични реакции, предизвикани от мембранните взаимодействия. За да допринесем за нови улики по този въпрос, ние тук използвахме нова повърхностно чувствителна техника на разсейваща микроскопия. С този подход открихме, че α-синуклеинът смущава везикулите постепенно и в зависимост от липидите вече при много ниско протеиново покритие.

Резюме

Взаимодействието на невроналния протеин α-синуклеин с липидните мембрани изглежда решаващо в контекста на болестта на Паркинсон, но основните механистични подробности, включително ролята на различните липиди в патогенната агрегация на протеини и разрушаването на мембраните, остават неуловими. Тук използвахме флуоресценция с единична везикуларна микроскопия и разсейване без етикет, за да изследваме кинетиката на взаимодействие на мономерния α-синуклеин с привързани към повърхността везикули, съставени от различни отрицателно заредени липиди. Подкрепени от теоретичен модел за отчитане на структурни промени в свойствата на разсейване на повърхностно привързани липидни везикули, данните показват поетапно разрушаване на везикулите и асиметрична деформация на мембраната при свързване на α-синуклеин с фосфатидилглицеринови везикули при концентрации на протеин до 10 nM (~ 100 протеина на мехурче). За разлика от тях фосфатидилсериновите везикули са били засегнати само незначително. Тези прозрения за структурните последици от взаимодействието на а-синуклеин с липидните везикули подчертават контрастните роли на различните анионни липиди, които могат да имат механистично значение както за нормалната протеинова функция (напр. Свързване на синаптичните везикули), така и за дисфункцията (напр. Митохондриално мембранно взаимодействие).

Резултати

α-синуклеин променя вискоеластичните свойства на повърхностно привързаните отрицателно заредени липидни везикули.

Преди да се насочат към измервания с единични везикули, MP-SPR и QCM-D бяха използвани за проверка на разрешени във времето промени в масата и структурните свойства, индуцирани от свързването на α-синуклеин към DOPG и DOPS везикули с повърхностно връзване. Везикулите бяха модифицирани с малка фракция (0,25 mol%) биотинови липиди за използване на NeutrAvidin като свързващ линкер към поли (l-лизин) -присадка-поли (етилен гликол) (PLL-g-PEG) сензорна повърхност, съдържаща 0,25% PLL-g-PEG-биотин. След добавяне на 200 nM α-синуклеин към DOPG или DOPS везикули, се наблюдава значително намаляване на резонансното изместване на честотата (Δf), измерено чрез QCM-D, което е придружено от увеличаване на разсейването на енергия (ΔD) (Фиг. 1А ). Контроли, използващи или 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфохолинови везикули, или голи PLL-g-PEG-биотин: PLL-g-PEG повърхността не показва признаци на взаимодействие на α-синуклеин (Приложение SI, Фиг. S1), потвърждаване, че отговорите, показани на фиг. 1А, са специфични.

QCM-D и SPR измервания на α-синуклеин, свързан с привързани към повърхността липидни везикули. (A) Еволюция на времето на Δf и ΔD при последващо добавяне на липидни везикули и α-синуклеин към PLL-g-PEG-биотин: PLL-g-PEG и NeutrAvidin-модифицирани сензорни повърхности при PLL-g-PEG-биотин: Съотношение PLL-g-PEG от 0,25%. Добавянето на α-синуклеин започва след наситено свързване на DOPG или DOPS везикули и изплакване с чист буфер. (B) Сензорни схеми на SPR с двойна дължина на вълната на промени в резонансното изместване на ъгъла, R, спрямо времето при λ = 670 nm за същия процес като в A, за DOPG (синьо) и DOPS (червено) везикули. (C) Еволюция във времето на промените в съотношението R670/R785 на SPR отговора за DOPG (синьо) и DOPS (червено). В B и C стрелките показват добавяне на α-синуклеин.

На пръв поглед е изкушаващо да се припише намаляването на Δf при инжектиране на α-синуклеин (t ≈ 20 минути) на увеличаване на свързаната маса, причинено от свързването на протеини с везикулите, докато придружаващото увеличение на ΔD може да бъде свързано с промени в структурата и вискоеластичните свойства на везикулите. Следвайки тази линия на разсъждения, последващото увеличаване на Δf (t ≈ 27 минути за DOPG и t ≈ 32 минути за DOPS) може да се интерпретира като десорбция на липид и/или α-синуклеин от повърхността на сензора. От предишни проучвания обаче е известно, че Δf може да бъде повлиян и от структурни промени на адсорбираните везикули, които в ситуации, когато молекулната маса остава по същество постоянна, се доминират от вариация в количеството на свързания разтворител (40).

За деконволюция на промените в свързаната молекулна маса от свързан разтворител използвахме MP-SPR, работещ на две дължини на вълната. Чрез тази техника интерфейсната област се сондира с изчезващи полета с две различни дължини на разпадане, което позволява дебелината на филма (или размерът на адсорбираните частици) да бъде директно определена от съотношението между съответните реакции, R1/R2. Това от своя страна дава възможност както да се идентифицират структурните промени на адсорбираните везикули, така и да се подобри точността на количественото определяне на масата (42), които бяха направени тук (за подробности вижте приложението SI, раздел 3), като се вземе предвид дебелината на филма ( Приложение SI, уравнения. S1 и S4 и фиг. S2), разликата в молекулното тегло между α-синуклеин (∼14 kDa) и липиди (∼0,8 kDa) и фактът, че протеините имат малко по-висок показател на пречупване от липидите (34, 46).

α-синуклеин предизвиква структурно ремоделиране на DOPG везикули с повърхностно връзване.

Разсейваща емисия на отделни DOPG везикули. Шест представителни профила на интензивност на разсейване (след изваждане на фона) на единични DOPG везикули при излагане на 10 nM а-синуклеин при t = 0. Разлика в абсолютните интензитети на разсейване между тези данни и фиг. 2В и приложението SI, фиг. S4 – S8 се дължи на разликите в интензитета на светлината, вариациите на чипа и времето за получаване на изображение. Профилите на интензитета са получени с помощта на немаркирани везикули.

Флуоресцентно изобразяване показва задържане на повърхността на липидите след индуцирано от α-синуклеин ремоделиране на везикули.

Промени в интензивността на флуоресценция на единични везикули при добавяне на α-синуклеин. (А) Флуоресцентна микрография, показваща същите DOPG везикули, съдържащи 1% родамин преди (t1 ≈ 0 s) и след (t2 ≈ 20 s) добавяне на α-синуклеин. Червените стрелки показват една и съща идентичност на везикулите при t1 и t2. (Мащабна лента: 2 µm.) (B) Флуоресцентна интензивност на отделни DOPG (синьо) и DOPS (червено) везикули преди времето на добавяне на α-синуклеин (t1) и до 40 s (t2) след добавяне. Линиите са линейни прилягания към нанесените точки с данни, а засенчената област съответства на средната квадратна грешка на напасването. (C) Хистограма на относителната промяна в интензивността на флуоресценцията между времената t1 и t2 за отделни DOPG и DOPS везикули. (D) Профил на интензивността на флуоресценция за напречно сечение на отделен DOPG везикул, регистриран в моменти t1 и t2. Съответната графика за DOPS не показва разлика между t1 и t2. (E) Промяната в напречното сечение FWHM за> 100 DOPG и DOPS везикули.

Изтичането на калцеин се предизвиква при взаимодействие на α-синуклеин с привързани DOPG везикули.

Анализ на изтичане на калцеин с единични везикули. (А) Схематична илюстрация на анализа. Везикулите са флуоресцентно маркирани от капсулиран калцеин (при концентрация, при която ефектът на самозаглушаване не е тежък). Мембранната пермеабилизация води до освобождаване на калцеин и по този начин до спадане на флуоресценцията на везикулите. (Б) Флуоресцентни микрографии, показващи калцеин, съдържащи везикули в различни времеви точки след добавяне на α-синуклеин. (Скала: 2 µm.) (C) Нормализирана флуоресценция (пунктирани линии) и разсейване (плътни линии) на интензивността на DOPG (синьо) и DOPS (червено) след добавяне на α-синуклеин при t = 0.

Дискусия

Въпреки това, разликите само в липидната група не са достатъчни, за да се обяснят всеобхватните различни ефекти, които α-синуклеинът има върху DOPG мембраните в сравнение с DOPS. Като се имат предвид свойствата на липидния бислой, ние отбелязваме, че рентгеновите дифракционни изследвания и ЯМР изследванията показват по-висок молекулярен ред в областта на полярната група на DOPS спрямо DOPG в ламеларна течна кристална фаза (54). Този факт, заедно с наблюденията, че α-синуклеинът се свързва с по-голям афинитет към моделни мембрани с ниска липидна плътност, висока кривина и/или такива, съдържащи нехомогенности (17, 26, 55, 56), е в съответствие с благоприятното взаимодействие с DOPG мембраните над DOPS, включително по-дълбоко вмъкване в DOPG бислоеве. В допълнение, предишни проучвания съобщават, че α-синуклеинът предизвиква несъвършенства чрез понижаване на твърдостта и дифузивността на мембраните (57, 58), което предполага, че динамичните нехомогенности в структурата на липидния бислой вероятно ще бъдат засилени от свързването на α-синуклеин, което води до промени в мембраната които могат да насърчат по-нататъшно свързване с протеини В DOPG мембраните, използвани тук, се наблюдават ефекти, индуцирани от α-синуклеин, които предизвикват верига от събития, които в крайна сметка насърчават асиметричен колапс на везикули в непосредствена близост до поддържащата повърхност и освобождаване на съдържанието на везикули.

Материали и методи

Материали.

DOPG и DOPS хлороформни разтвори и DSPE-PEG (2000) Биотин (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоетаноламин-N- [биотинил (поли-етиленгликол) -2000], амониева сол) са от Avanti Polar Lipids . Rhodamine DHPE е от Invitrogen. Натриев фосфат едноосновен (NaH2PO4; ≥99%), натриев фосфат двуосновен (Na2HPO4; ≥99.0%), етилендиаминтетраоцетна киселина (EDTA; ≥99%), NeutrAvidin и калцеин са закупени от Sigma-Aldrich.

Експресия и пречистване на протеини.

Подготовка на липидни везикули.

Везикулите се приготвят по метода на хидратация и екструзия на липидния филм. Подходящи обеми разтвор на хлороформ на DOPG или DOPS се прехвърлят в колба с кръгло дъно. Биотинилираните везикули се приготвят чрез смесване на 1% от общата липидна маса на DSPE-PEG (2000) биотин (разтворен в метанол) с DOPG или DOPS в органичния разтвор. В случай на флуоресцентно белязани везикули, родамин DHPE също се добавя (1 тегл.%) Към везикулите. Органичните разтворители се отстраняват чрез ротационно изпаряване и полученият филм се суши под вакуум в продължение на най-малко 3 h, хидратира се с 20 mM фосфатен буфер, 1 mM EDTA, рН 6.5 и се завихря за 10 минути. Размерът на везикулите беше намален чрез екструзия с помощта на екструдер Avestin LiposoFast-Basic и поликарбонатни мембрани с размер на порите 100 nm.

Всички измервания бяха извършени с помощта на Q-Sense E4 (Biolin Scientific) и SiO2 покрити кристали (Q-Sense, Biolin Scientific), почистени чрез обработка с ултразвук (Elmasonic, Elma Schmidbauer GmbH) с натриев додецил сулфат (SDS, Sigma-Aldrich) и ултрачист H2O (Synergy системи, Merck Millipore Corporation) преди изсушаване с поток от обработка с N2 и UV/Ozone (UV/Ozone Procleaner Plus, BioForce Nanosciences) за 30 минути. Базовата линия се нормализира с фосфатния буфер, описан по-горе преди всеки експеримент. В началото на експеримента повърхността на сензора беше покрита с 10 µg/mL PLL-g-PEG (PLL (20) -g [3.5] -PEG (2) от SuSOS AG), с 0.25% или 1% от PLL-g-PEG, функционализиран с биотин (PLL (20) -g [3.5] -PEG (2)/PEGbiotin (3.4) 50% от SuSOS AG). Когато се достигне насищане, се добавя NeutrAvidin при концентрация от 10 ug/ml, докато не се наблюдава допълнително свързване. Към това се добавят везикули (100 ug/ml липидна концентрация), съдържащи 1% биотинилирани липиди, докато се достигне насищане, последвано от а-синуклеин. Клетките на пробата се изплакват с буфер между всяко добавяне.

MP-SPR.

Измерванията на повърхностния плазмонен резонанс с двойна дължина на вълната (SPR) бяха извършени с SPR Navi 220A (BioNavis) върху покрити със SiO2 чипове (SPR102-SIO2, BioNavis), първо почистени чрез изплакване в 10 mM SDS с последващо изплакване в ултрачиста вода. След изплакване чипсът се изсушава в азотен поток и след това се обработва с UV/озон (UV/Ozone Procleaner Plus, BioForce Nanosciences, Inc.) за 30 минути. След процедурата за измиване, чипът след това се закачи в SPR инструмента и се грундира с циркулиращ буфер при 20 μL/min. Чипът е покрит с PLL-g-PEG-биотин: PLL-g-PEG и везикули, привързани през NeutrAvidin, както е описано за експерименти QCM-D, и SPR е наблюдаван при дължини на вълните 670 и 785 nm за интервал на сканиране между ∼65 ° и 78 °. Измерванията бяха извършени при 21 ° С.

Изработване на вълноводни чипове и модификация на повърхността.

Настройка на микроскопия.

Всички измервания на вълноводи бяха извършени върху вертикален микроскоп Olympus BX61, оборудван с обектив за потапяне на вода 100 ×, NA 1.0 Leica и научна допълнителна полупроводникова камера с метален оксид Hamasatsu ORCA Flash V2 (CMOS), свързана с изображение на Hamamatsu W-VIEW GEMINI сплитер, съдържащ специфични филтърни кубчета (дихроично огледало: 562 nm; флуоресцентна лента: 590/50; и лента на разсейване: 535/50), позволяваща едновременно получаване на флуоресцентни и разсейващи сигнали. Функционализиран чип с волновод се постави под обектива и едномодовата, 532 nm, TE поляризирана светлина (от NANO 250 [Qioptiq, Inc.] лазер, свързан с влакна) беше прикачена към чипа чрез едномодово влакно който беше внимателно подравнен към фасета на вълновода с помощта на ръчен триосен транслационен етап. След като се подреди, разтвор, съдържащ везикули, се излага на чипа и повърхностното свързване на везикулите се наблюдава в реално време. Когато се постигне подходящо покритие на повърхността, чипът се изплаква с буфер и впоследствие се излага на α-синуклеин. За повече подробности относно вълноводния чип и експериментална настройка вижте ref. 67.

Измервания на разсейване и флуоресценция с едно везикули.

Пробите с липидни везикули с повърхностно връзване се приготвят, както е описано по-горе. Пробата е изобразена с помощта на описаната по-горе настройка на микроскопа със време на интегриране от 100 ms при 0,1 кадъра в s. Сигналите за разсейване и флуоресценция се записват едновременно с помощта на устройство за разделяне на изображението. Записаните изображения са анализирани в ImageJ. Първо, съответните флуоресцентни и разсейващи изображения бяха подравнени с помощта на вграден модул за подравняване в ImageJ. След това се получава интензитет на единични везикули чрез интегриране на интензитета в зона, ограничаваща сигнала на везикула. Тази област беше дефинирана в края на записа, за данните за флуоресценцията (отпечатъкът на сигнала нараства с времето) и в началото на записа, за данните за разсейване (отпечатъкът на сигнала остава по същество постоянен във времето). Средният интензитет на фона на пиксел се оценява локално за всеки везикул и се изважда от неговата интегрирана интензивност на разсейване и флуоресценция.

Анализ на течове.

Биотинилирани везикули с капсулиран калцеин в концентрация 30 mM, при които ефектът на самозаглушаване е достатъчно слаб, за да позволи отделните везикули да бъдат откриваеми, бяха получени чрез хидратиране на липидния филм с фосфатен буфер, съдържащ багрилото. Калцеинът се разтваря в алкална среда (1 М NaOH) и след това се разрежда с фосфатен буфер (20 тМ фосфатен буфер, 1 тМ EDTA, рН 6.5). Везикулите бяха завихрени, екструдирани и обездвижени върху повърхността на чипа, както е описано по-горе. Свободният калцеин се отстранява чрез измиване на имобилизираните везикули с фосфатен буфер преди добавяне на а-синуклеин. Излъчването на флуоресценция беше открито, като се използва 100-ms време за интегриране. На всеки 2 s се записва изображение, за да се осигури продължително време на запис, без да се предизвиква значително избелване на багрилата в пробата. Трябва да се отбележи, че наличието на калцеин във везикулите има очевидно отрицателно въздействие върху способността на α-синуклеин да взаимодейства с липидните мембрани, използвани в това проучване. За да се получи подобно ниво на взаимодействие, измерено чрез QCM-D (представено в допълнение SI), се изисква 10 пъти по-висока концентрация на α-синуклеин. Това означава, че количествените резултати, получени с помощта на различните методи, не са пряко сравними.

Наличност на данни.

Всички данни и процедури са предоставени в ръкописа и приложението SI.

Благодарности

Тази работа беше подкрепена от Фондацията на Кнут и Алис Валенберг, Шведския изследователски съвет и Гранта за предварително семе на университета Чалмърс. Благодарим на Ranjeet Kumar (Катедра по биология и биологично инженерство, Технически университет Chalmers) за експресията и пречистването на α-синуклеин. Тази работа беше извършена частично в лабораторията за анализ на материалите на Чалмерс (CMAL).